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1、1乳腺癌 SLN 中 CD8+T 细胞及 DC 的动态分析作者：何建军，任予，霍永平，张云锋，王珂，陈武科 【关键词】 西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科，陕西 西安 710061 【Abstract】 AIM: To analyze dynamically the changes of CD8+T cells and dendritic cells (DC) in sentinel lymph node (SLN) in breast cancer. METHODS: A total of 82 SLN, from 31 breast cancer patients undergoing
2、 the SLN biopsy from April 2001 to June 2003, were examined in the study. Of the 31 patients, 12 had micrometastasis in SLN observed through the detection of CK19 mAb, 9 were proved of nonmetastasis in SLN and the other 10 had metastasis found by HE staining. With SABC immunohistochemistry for CD8 m
3、Ab and S100 polyclonal antibody, we got the ratios of positive cell numbers to total lymphocyte number in 5 highpower fields and counted their average. RESULTS: Among the 82 SLN, nonmetastasis was found in 35 SLN, micrometastasis in 20 SLN, and metastasis in 27. The average ratios of CD8+T cells and
4、 S100+ DC to total lymphocyte were different significantly among the 3 groups (P0.01). CONCLUSION: 2Tumor metastasis in SLN in breast cancer, even micrometastasis, would lead to the notable decrease of CD8+ T cells, while it would not result in the obvious change of DC number, except that the remark
5、able metastasis would reduce the DC. 【Keywords】breast neoplasms; sentinel lymph nodes (SLN); CD8positive Tlymphocytes; dendritic cells 【摘要】目的： 分析乳腺癌 SLN 中 CD8+T 细胞及 DC 的变化规律. 方法： 自 200104/200306 所进行的乳腺癌 SLN 活检病例中，选择应用 CK19 mAb 检测到 SLN 具有微转移的患者 12例，并随机选择无转移的 9 例，HE 有转移的 10 例共 82 个 SLN. 将 82 个 SLN 分为无
6、转移、微转移及转移组；选择 CD8 单抗及S100 多抗，采用免疫组化 SABC，计数 5 个高倍视野下阳性染色细胞数和淋巴细胞总数的比值，取其平均值，得出阳性细胞百分比率. 结果： 82 个 SLN 中未转移 35 个，微转移 20 个，转移 27 个；三组淋巴结中 CD8+T 细胞和 S100+ DC 占总淋巴细胞的比率有统计学差异（P0.01 ）. 结论： 乳腺癌 SLN 中一旦出现肿瘤转移，即使是微转移，也能使 CD8+T 细胞的数量明显减少；SLN 出现微转移对 DC 数量无明显影响，而一旦出现明显转移，则可使 DC的数量显著减少. 【关键词】 乳腺肿瘤；前哨淋巴结；CD8 阳性 T
7、 淋巴细胞；树突细胞 30 前言 Alessandro1认为肿瘤区域引流淋巴结是抗肿瘤免疫反应产生的初始和主要部位，在其中可出现一系列的肿瘤免疫反应. 前哨淋巴结（SLN ）是区域淋巴引流的第一位点，从肿瘤组织引流的物质可能首先到达 SLN 中. 我们采用免疫组化的方法，观察乳腺癌 SLN 中在无转移、微转移及转移状态下 CD8+T 细胞及S100+DC 的动态变化规律 . 1 对象和方法 1.1 对象 200104/200306，采用前哨淋巴结活检方法2 ，选择应用 CK19 mAb（武汉博士德公司）检测到具有微转移的患者 12 例，并随机选择无转移的 9 例，HE 有转移的 10 例共 8
8、2个 SLN，再次应用常规病理及 CK19 mAb 检测微转移. 将 82 个SLN 分为无转移、微转移及转移组；所有的患者术前均未接受化疗或放疗. 鼠抗人人 CD8 mAb 和鼠抗人 S100 多抗（Novocastra Laboratories Ltd, UK）. 1.2 方法采用免疫组化 SABC 法，每批实验均设阴性对照（PBS 液替代一抗）和阳性对照（人扁桃体组织）. 染色过程：脱蜡水化、抗原修复、封酶、每张切片滴加 50 L 左右一抗（CK19mAb1100 倍稀释、CD8mAb 及 S100 多抗 150 倍稀释） ，37孵育 90 min，PBS 冲洗，5 min3 次；每张切
9、片滴加50 L 左右的生物素标记的二抗（兔抗鼠的 IgG） ，37孵育 30 4min，PBS 冲洗，5 min3 次；然后滴加链霉卵白素 生物素复合物，37孵育 20 min；再加 50 L 左右的增强剂， 37 浸泡 20 min，PBS 冲洗，5 min3 次；再滴加链霉卵白素 辣根过氧化物酶，37孵育 20 min，PBS 冲洗，5 min3 次；然后每张切片滴加新配制的 DAB 显色液，镜下观察控制显色反应；苏木素复染核 6 min，自来水冲洗，中性树胶封片 . 观察标准： 选择免疫组化染色阳性细胞密集区域，取 5 个高倍视野（400） ，以目镜测微网计数阳性染色细胞数和淋巴细胞总数
10、，取其平均值，得出阳性细胞占总淋巴细胞数的百分比率. 微转移的判断标准：HE 未发现转移，应用 CK19 mAb 行免疫组化，在 SLN 中发现单个肿瘤细胞或肿瘤细胞团直径小于 2 mm 的转移灶. 统计学处理： 不同转移状态下 SLN 的阳性细胞用平均比率xs 表示. 所有数据均经 SPSS10.0 统计软件包处理，包括方差齐性分析（显著性水准双侧 =0.05） ，t 检验（显著性水准双侧=0.01） ，单因素方差分析（显著性水准双侧 =0.01）. 2 结果 本实验 82 个乳腺癌 SLN，无转移 35 个，微转移 20 个，转移淋巴结 27 个. 2.1CD8+T 细胞在 SLN 中的表
11、达 CD8 主要表达在淋巴细胞胞膜上，部分胞质内有少许表达（图 1）. 经免疫组化染色后阳性产物呈弥漫的黄色、棕黄色颗粒. 无转移、微转移及转移 SLN 中5CD8+T 细胞占总淋巴细胞的比率分别为 8.21.6，5.31.6 和4.72.3，单因素方差分析显示三组存在统计学差异（F=31.406， P0.01）. LSDt 检验进行三组间均数的多重比较，无转移组与微转移组、无转移组与转移组 CD8+T 细胞占总淋巴细胞的比率有显著性差异（P0.01 ） ，而微转移组和转移组无统计学意义（P=0.274）. 说明 SLN 在无转移状态时 CD8+T 细胞的数量明显多于出现微转移和转移时，而微转
12、移和转移时 CD8+T 细胞的数量无明显变化. A： 未转移；B： 微转移；C： 转移. 图 1CD8+T 细胞在乳腺癌 SLN 中的表达400（略） 2.2S100+细胞在 SLN 中的表达 S100+主要表达在淋巴细胞胞膜上，部分胞质内亦有表达；经免疫组化染色后阳性产物呈弥漫的黄色、棕黄色颗粒（图 2）. 无转移、微转移及转移 SLN 中S100+细胞占总淋巴细胞的比率分别为 4.11.6，3.51.7 和2.51.1；三组存在统计学差异（F=9.171， P0.01）. LSDt检验进行三组间均数的多重比较，无转移组与微转移组差异无统计学意义，而它们均与转移组的差异具有统计学意义. 说明
13、 SLN 在无转移和微转移状态时，S100+ 细胞标记的 DC 数量相等；而一旦出现转移， DC 的数量明显减少 . A： 未转移；B： 微转移；C： 转移. 图 2S100+细胞在乳腺癌 SLN 中的表达400（略） 3 讨论 6CD8+T 细胞是一种细胞毒 T 细胞，主要产生特异性细胞免疫. 在肿瘤引流淋巴结的肿瘤免疫研究中，CD8+T 细胞也是一个主要研究的免疫细胞. Lores 等3 通过 T 淋巴细胞的多种膜标志包括 CD8+T 细胞来研究肿瘤引流淋巴结中的肿瘤免疫，发现在引流淋巴结中肿瘤转移出现的早期呈现强烈的免疫反应，但不久就下调了. 这一结果在本实验中得到验证， CD8+T 细
14、胞占总淋巴细胞数的比率在无转移组与微转移组间有明显差异，而微转移组与转移组间未显示差异. 王水等4采用流式细胞技术比较乳腺癌 SLN 与非SLN 中免疫功能，发现肿瘤未转移时，SLN 的 CD8+T 细胞数量与非 SLN 差异无显著性；而当肿瘤转移时，SLN 和非 SLN 的 T 细胞的比例发生显著性改变，由正常的以 CD4+T 细胞为主，转变为以CD8+T 细胞为主. 该结果似乎与本研究结果相反，考虑除与不同研究方法以及样本量偏小有关外，本研究结果显示无转移、微转移及转移的 SLN 中，CD8+T 细胞占总淋巴细胞的比率呈现递减趋势，而非比较的 SLN 中的 CD8 +T 细胞数量，以后研究
15、中 SLN 淋巴细胞群谱的描绘将有助于解释这两个研究结果的不同. IDCs 位于淋巴组织 T 细胞区，由 LC 移行至淋巴结而来，高表达 MHC, MHC 类分子和 S100 蛋白，具有较强的免疫激活作用. DC 在成熟过程中，同时发生迁移，由外周组织通过淋巴管和（或）血液进入次级淋巴器官，然后激发 T 细胞应答. Sakakura等5认为区域淋巴结中树突细胞密度、数量的变化反映了机体抗7肿瘤能力的变化，树突细胞减少是机体全身或局部淋巴结中免疫力下降所致. 因此，局部淋巴结中 DC 的密度、数量可能更好地反映机体抗肿瘤免疫力. Huang 等6应用免疫组化的方法研究乳腺癌SLN 和非 SLN
16、中 S100+DC 的变化规律，发现 SLN 中 DC 的密度以及 DC 的计数明显低于非 SLN 中，从而认为是肿瘤导致 DC 的数量减少. 本研究显示在 SLN 处于微转移状态时 S100+DC 的数量与无转移状态时无明显的差异，但当 SLN 出现明显转移时，S100+DC 的数量则明显减少，具有统计学意义. 说明微转移状态对 DC 数量的影响不明显，而一旦出现明显转移，则可明显使 DC的数量减少，从而使细胞免疫受到抑制. 从上述两种细胞数量的改变，我们发现，随着 SLN 中肿瘤转移的逐渐出现，细胞免疫逐渐受到抑制，呈现一个动态的变化过程. 我们计划从分子生物学的水平来进一步研究 SLN 中免疫细胞的功能改变，以从肿瘤引流淋巴结的角度更加深入的认识肿瘤免疫抑制的机制. 【参考文献】 1 Alessandro DS. Lymph node
