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1、1Caspase1 抑制剂对大鼠急性痛风性关节炎的作用作者：谷祖华 苗志敏 李长贵 【摘要 】 目的 研究 Caspase1抑制剂 ACYVADCMK对尿酸钠晶体诱导大鼠急性痛风性关节炎(GA)的作用。方法 选用健康雄性 Wistar 大鼠 50 只，按随机区组法将大鼠分为 5 组：空白对照组(A 组)，模型组 (B 组)，秋水仙碱组(C 组)，低剂量ACYVADCMK组(D 组)，高剂量 ACYVADCMK组(E 组) ，每组 10 只。采用尿酸钠晶体制备大鼠 GA 模型，造模后给药 3 d，A、B 组给予生理盐水，C 组给予秋水仙碱， D、E 组给予不同剂量 ACYVADCMK。用皮尺测定
2、造模后2、4 、6 、 8、24 、48 、72 h 大鼠的踝关节周径;造模后 72 h，麻醉后心脏取血，生理盐水冲洗关节腔,行白细胞计数;采用放射免疫分析法测定大鼠关节冲洗液及血清中白细胞介素 1(IL1)的水平;以苏木精 伊红染色观察大鼠关节滑膜的病理学改变。结果 造模后 72 h， ACYVADCMK能显著降低 GA 模型大鼠的踝关节肿胀度及关节冲洗液、血液白细胞水平(F=10.3444.66，P0.01)。放射免疫分析检测结果显示，ACYVADCMK 可显著降低 GA 大鼠关节冲洗液及血清中 IL1的水平(F=4.34 、 4.49，P0.01)。病理组织学检查结果显示，ACYVADC
3、MK 可减轻 GA 模型大鼠踝关2节滑膜增生，减少关节组织炎性细胞浸润。结论 ACYVADCMK对尿酸钠晶体诱导大鼠 GA 有显著的改善作用，其机制可能与降低IL1水平有关。 【关键词】 ACYVADCMK;尿酸; 关节炎 ,痛风性;白细胞介素 1 ABSTRACT Objective To study the effect of Caspase1 inhibitor ACYVADCMK on acute gouty arthritis (GA) induced by monosodium urate in rats. Methods Fifty healthy female Wistar r
4、ats were enrolled and equally randomized to five groups as: blank control (group A), model (group B), colchine (group C), lowACYVADCMK (group D) and highACYVADCMK (group E). GA models were made using sodium urate crystal and medicating for three days: normal saline for the rats in groups A and B; co
5、lcnine for those in group C; different doses of ACYVADCMK for groups D and E. The circumference of the ankle joints was measured by tape at 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 24 h, 48 h, and 72 h after modeling. At 72 h after modeling, blood was taken from the hearts under anesthesia and the articular cavities wer
6、e irrigated with normal saline, a white blood count was done. IL1 in joint douche was detected by radioimmunoassay. Pathological changes in synovium of joint were observed with HE staining. ResultsAt 72 h after modeling, ACYVADCMK could 3significantly relieve arthrocele in rat and decline leucocytes
7、 in blood and in rinse solution of joint (F=10.34-44.66,P0.01). Radioimmunoassay revealed that ACYVADCMK could greatly reduce levels of IL1 in blood and in rinse solution of joint (F=4.34,4.49;P0.01). Histopathologically, ACYVADCMK could abate synovium proliferation of ankle joint,reduce inflammator
8、y cell infiltration of articlar tissue. Conclusion ACYVADCMK has remarkable effect on improving symptoms of acute gouty arthritis induced by monosodium urate crystals in rats,which might be related to its inhibition on levels of IL1. KEY WORDS ACYVADCMK; Uric acid; Arthritis, gouty; Interleukin1 痛风性
9、关节炎(GA) 是尿酸盐结晶沉积于关节及周围组织所致的一种代谢性关节疾病。尿酸钠(MSU)晶体已被证实为 GA 发作的关键因素，由 MSU 晶体刺激诱导的固有免疫应答在 GA 的发病中起着重要的作用。在 NALP3 inflammasome 参与下生成的白细胞介素 1(IL1)是 GA 发作的关键因子1。ACYVADCMK 是一种 Caspase1 抑制剂 ,可以阻断 Caspase1激活前体 IL1,减少成熟 IL1的产生。本研究通过关节局部注射 MSU 晶体诱导大鼠GA 模型,以观察 Caspase1 抑制剂对 GA 的影响。 1 材料和方法 41.1 实验动物 健康雄性 Wistar 普
10、通级大鼠 50 只, 体质量(20020)g，由青岛市药检所提供，饲养于我院动物实验中心，使用前适应性喂养1 周，饮食、饮水、活动正常，无不良反应即开始实验。整个实验过程中自由摄食和饮水。 1.2 主要试剂 秋水仙碱片( 西双版纳药业有限责任公司，批号 070101)，吐温80(Sigma 分装，C283) ，尿酸(Alfa Aesat, Lot：10105129)，acetyltyrosylvalylalanylaspartylchloromethylketone (ACYVADCMK)购于 ALEXIS,批号 260028M005, 大鼠IL1酶联免疫吸附反应检测试剂盒(R&D 分装)。
11、1.2.1 药物配置 秋水仙碱乳悬液：将秋水仙碱片放入研钵内研成细末、过筛。将 10 mg 秋水仙碱溶解于 100 mL 生理盐水中，制备成 100 mg/L 秋水仙碱混悬液。ACYVADCMK 溶液：每天早晨将 5 mg ACYVADCMK溶于 30 mL PBS 溶液中。 1.2.2 MSU 结晶及溶液的制备 参考 CODERRE 等2介绍的方法略作改进,在 194 mL 蒸馏水中加入 1 mol/L NaOH 6 mL,煮沸,加尿酸 1 g,用 1 mol/L HCl 调 pH 值至 7.2,搅拌冷却,4 冰箱保存 24 h,去上清液,用滤纸将沉淀物水分吸干,放入干燥箱 ,70 烘 2
12、h,取出,刮下粉末,放入研钵内研成细末, 用孔径 200 m的金属网筛过筛,装瓶备用。实验前 MSU 结晶 180 烘 3 h，500 mg MSU 结晶加 9 mL 生理盐水, 再加 1 mL 吐温80, 加热搅拌,配成 10 mL 50 g/L 5MSU 溶液。 1.3 模型的制备 用 6 号注射针从受试大鼠右后肢踝关节背侧 45方向插入胫骨肌腱内侧,将 0.05 mL MSU 溶液注入到踝关节腔,制备急性 GA 模型 (参考文献2,3并略作改进) 。 1.4 实验分组及给药方法 将 50 只大鼠随机分为空白对照组(A 组) 、模型组(B 组)、秋水仙碱组(C 组)、低剂量 ACYVADC
13、MK组(D 组)、高剂量ACYVADCMK组(E 组)，每组 10 只。C 组给予秋水仙碱 1 mL/100 g，造模后开始给药，早晚各一次，连续灌胃 3 d;A 组和B 组造模后灌胃等量的生理盐水，连续 3 d;D 组腹腔注射ACYVADCMK 0.1 mg/100 g，造模后开始给药，早晚各一次，连续 3 d;E 组腹腔注射 ACYVADCMK 0.3 mg/100 g，造模后开始给药，早晚各一次，连续 3 d。 1.5 观察指标及评价方法 观察指标包括周径、肿胀情况3。 周径测量：通过皮尺测量实验前和造模后 2、 4、6、8 、24、48 和 72 h 右踝关节同一部位的周径。炎症指数分
14、级标准：正常为 0 级(0 分);关节皮肤红斑，轻度肿胀，骨性标志可见为 1 级(2 分);关节明显红肿，骨性标志消失，但肿胀局限于关节部位为 2 级(4 分);关节以外肢体肿胀为 3 级(6 分)。 1.6 标本采集及检测 6造模后 72 h，以 100 g/L 水合氯醛 0.8 mL 麻醉大鼠后心脏取血，1 mL 注入 EDTA 抗凝管，其余注入普通管。抗凝血用CELLDYN1700细胞计数仪在 2 h 内进行白细胞计数，检测前混匀。非抗凝血 37 温育 30 min，3 000 r/min 离心 10 min，取上清置于-70 冰箱冻存。关节腔内用 0.5 mL 生理盐水冲洗，留取冲洗液
15、，取 0.05 mL 立即镜检计数白细胞。冲洗液置于-70 冰箱冻存。血清及关节冲洗液 IL1检测采用 ELISA 法，严格按照试剂盒说明书进行。分别取踝关节滑膜于 40 g/L 中性甲醛溶液固定，100 g/L 乙二胺四乙酸脱钙，常规脱水、透明、包埋、切片和苏木精 伊红染色,光镜下观察局部病理组织学变化。 1.7 数据处理与统计学分析 结果以s 表示，采用 SPSS 16.0 软件处理。各组均数间比较采用 oneway ANOVA 分析，组间两两比较采用 LSD 检验。 2 结 果 2.1 一般情况 入组大鼠 50 只，均进入结果分析，无脱失。造模后大鼠明显烦躁不安，右踝关节明显红、肿、热、
16、痛，且伴有功能障碍，活动受限。对照组无明显躁乱表现，关节与造模前相比略有增粗，无明显红、热及功能障碍的表现。 2.2 药物对 GA 大鼠踝关节周径的影响 造模后各组大鼠关节肿胀度均有所增加，且 824 h 达到高峰，其中以 B 组最为明显, 与 A 组比较有显著统计学意义7(F=10.3441.56，P0.01)。各药物干预组关节肿胀程度与 B 组相比均有不同程度的下降，D 组与 B 组相比无统计学意义，E 组从4 h 开始与 B 组相比有显著统计学意义(P0.05、0.01)，C 组从 8 h 开始与 B 组相比有显著统计学意义 (P0.05、0.01)。见表 1。 2.3 药物对 GA 大鼠踝关节炎症指数的影响节炎症指数有显著统计
