《Borna病病毒与淋巴瘤关系的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Borna病病毒与淋巴瘤关系的初步研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1Borna 病病毒与淋巴瘤关系的初步研究作者：杨泽松，陈建斌，牟君，谢鹏，赵立波，张小东，李勇【摘要 】 目的 探讨 Borna 病病毒（BDV）感染与人类淋巴瘤的关系。 方法 采用荧光定量套式逆转录酶聚合酶链式反应(FQ-nRT-PCR)，检测了经病理学诊断的非霍奇金淋巴瘤（NHL）14 例、霍奇金淋巴瘤（HD）6 例及健康人 20 例的外周血单个核细胞（PBMC）中 BDV p24 基因片段。 结果 20 例淋巴瘤患者与20 例健康对照者的 BDV p24 基因片段检测均为阴性。 结论淋巴瘤与 BDV 感染无明显相关性。 【关键词】 淋巴瘤Relationship between Lym
2、phoma and Borna Disease VirusAbstract: Purpose To explore the relationship between lymphoma and infection of Borna disease virus (BDV). Methods The p24 fragment of BDV RNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in 14 cases with 2pathologically proved non-Hodgkin lymphoma（NHL）, 6 cases with pat
3、hologically proved Hodgkin lymphoma （HD） and 20 volunteers was examined by fluorescence quantitative nested reverse transcriptase polymerase chain reaction (FQ-nRT-PCR). Result The BDV P24 fragment was not found in 20 patients with lymphoma and 20 volunteers. Conclusion The infection of BDV may be n
4、ot correlated to lymphoma.Key words: lymphoma; Borna disease virus（BDV）; polymerase chain reaction (PCR)Borna 病病毒（Borna disease virus，BDV）是一种高度嗜神经性的 RNA 病毒，能引起马的致死性脑炎即 Borna 病（Borna disease，BD）1 。有研究提示， BDV 可能与人类肿瘤发生有关。近年来有报道 BDV 磷蛋白 p24 能直接与一种多功能蛋白amphterin（HMGB1）的 A-box 结构域结合，这一结构域与肿瘤抑制因子 p53 有交互作
5、用，并证明 BDV 磷蛋白 P 可能是与HMGB1 结合而抑制 p53 的一种特殊抑制因子，这可能是 BDV 感染诱发肿瘤的机制之一2。我们采用荧光定量套式 RT-PCR（fluorescence quantitative nested RT-PCR，FQ-nRT-PCR）检测临床经病理诊断的淋巴瘤患者外周血单个核细胞3（PBMC）中 BDV p24 基因片段。现将初步结果报道如下。1 材料与方法11 研究对象20 例病例均系我院血液内科 2004 年 1 月至 2005 年 6 月经病理学确诊的淋巴瘤初诊住院患者，其中非霍奇金淋巴瘤（NHL）14 例(男性 9 例，女性 5 例，平均年龄 3
6、0.312.4 岁，B 细胞淋巴瘤 4例，T 细胞淋巴瘤 10 例)，霍奇金淋巴瘤（HD）6 例(男性 4 例，女性 2 例, 平均年龄 26.17.5 岁，淋巴细胞为主型 2 例，淋巴细胞衰减型 3 例，混合细胞型 2 例)。以上患者临床分期均为B 期。20例患者均出现不同程度的发热、盗汗和体重减轻，均无肿瘤及肿瘤家族史。来自农村的患者 11 例，来自城市者 9 例。7 例患者有长期（315 年，平均 9.53.3 年）动物密切接触史，但均否认与患病动物或病死动物接触史，其中养猫者 2 例，养狗者 3 例，养牛者 1例，养羊者 1 例；有较长期野外工作史（从事地质勘探工作 35年）者 2 例
7、；有较长接触苯等装修材料者 2 例；其余患者均无密切接触动物史和长期野外工作史及接触苯等装修材料史。健康对照男女各 10 例，平均年龄 29.39.2 岁。12 主要试剂及仪器4引物序列由上海博亚生物技术有限公司合成；荧光探针的序列由中山大学达安基因诊断中心合成。Roter-Gene3000 荧光定量 PCR仪（澳大利亚 Corbett Research 公司） ，四甲基罗达明（tramethylrhodamine，TAMRA） ，PE394 探针合成仪（美国Perkin Elmer 公司） ，淋巴细胞分离 Ficoll-conray 液（上海恒信化学试剂有限公司） ，Tripure RNA
8、提取试剂盒（Boehring-Mannheim 公司）等。13 实验方法131 引物和探针设计、合成从美国国立卫生研究院基因列数据库（GeneBank ）中调出BDV 的第二开放阅读框（ORF ）区序列，设计扩增 BDVp24 基因片段的引物序列为：外引物：P1：5-TCAGACCCAGACCAGCGAA-3(19bp)；P2：5-ATCTGGGGATAAATGCGCG-3(19bp)。内引物：P1：5-CCCTCCAAGTGGAAACCAT-3(19bp)；P2：5-CAGTATCTTGATGTTCTCGCCA-3(22bp)。设计荧光定量 PCR BDVp24 基因片段探针序列为： 5-（
9、FAM）TCAGCGGTGCGACCACCACTCCGATAGC（TAMRA）-53（25bp） ，其中 5标记的荧光发光基团为 TAMRA。探针纯化采用 15%聚丙烯凝胶电泳后分割胶分离纯化，纯化后的探针测定其OD 值，计算其含量，置-20备用。132 提取细胞 RNA本实验凡涉及 RT-PCR 实验的所有用品均严格按消除 RNase 的常规方法处理。每例实验对象均采外周血 10ml，用 Ficoll-conray液分离 PBMC，采用 Tripure RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA，标本置-20 保存3。随机取 3 份提取的 PBMCs 总 RNA，1%琼脂糖凝胶电泳后判断其纯度。取
10、 5l 提取的 PBMCsRNA 稀释 100倍，用紫外分光光度计测定 OD 值，并计算其浓度。133 BDVp24 阳性定量标准曲线的建立取 10l 已纯化的阳性重组质粒3，稀释 50 倍，紫外分光光度仪上测定其 OD 值，计算其浓度。分别用 10mM Tris-Cl 稀释成107、 106、 105、104、103 拷贝数/l 浓度梯度，加 5l 于不同反应管中在 Roter-Gene3000 荧光定量 PCR 仪上进行扩增3 。所有反应信息资料被 Roter-Gene3000 荧光定量 PCR 仪收集并储存，反应结束后根据阳性定量标准模板的扩增情况自动绘制出标准曲线。6134 FQ-nR
11、T-PCR进行常规套式 nRT-PCR3时，在第二轮扩增 amplification 的反应混合物（reaction mixture）中加入荧光标记探针进行荧光定量 PCR，扩增 BDV ORF 基因目的片段为 86bp。进行逆转录反应，在含样本 RNA 的反应管中加入逆转录体系 9l，外引物一对各0.5l，逆转录酶 MMLV 20u，总反应体积 11l，37 60 min，95 3min。取逆转录后反应液 10l，加外引物一对各1l，进行第一轮 PCR；第二轮 PCR 总反应体积 50l，含第一轮扩增产物 5l，10mM dNTP 1l，Taq 酶 3u，25mM MgCl2 10l，内引物
12、一对各 1l，荧光标记探针 1l。每份标本同时检测-actin 作内参照。每次实验设阴性对照。135 BDV p24 基因 cDNA 片段的克隆及测序阳性 PCR 产物用醋酸钠、乙醇沉淀法纯化后与 T 载体连接，转化大肠杆菌，采用蓝白斑及菌落FQ-PCR 鉴定筛选重组子，每一标本同时收集 3 个阳性菌落培养。集菌提取质粒 DNA，再用 FQ-PCR 进行鉴定，阳性质粒重组子送上海生物工程有限公司测序。14 统计学方法7采用 SAS 软件进行 Fisher 精确概率检验。2 结 果2.1 PBMCs 总 RNA 的提取质量和纯度4 份样本电泳后可见 28s、18s 两条清晰的条带和稍欠清晰的 5
13、s条带，说明提取的 RNA 样品纯度较高，完整性较好，无 DNA 污染，无降解。并测定其 OD 值，OD260/OD280 分别为1.795、1.846、1.733，均在 1.7 以上，说明提取的 RNA 样品纯度较高，计算 RNA 浓度分别为 0.524、0.872、0.416g/l。RNA的提取质量达到 PCR 要求。2.2 标准阳性曲线的建立阳性模板共 5 个梯度，扩增后均呈典型的 S 形曲线，阴性对照无荧光量改变，取其中 3 个变异程度最小的梯度制定阳性标准曲线；起始模板数与循环阈值（Ct 值）之间有良好的线性关系，相关系数r=0.999。2.3 标准曲线中阳性质粒扩增与测序8阳性模板
14、中提取质粒 DNA，再用 FQ-PCR 进行鉴定，阳性质粒重组子送上海生物工程有限公司测序,测序结果均为5CCCTCCAAGTGGAAACCATCC-AGACAGCTCAGCGGTGCGACCACTCCGACAGCAT-CAGGATTCTTGGCGAGAACATCAAGATACTG3。登陆美国国家生物技术信息中心(NCBI)，并用 BLAST 软件对 Genebank 数据库进行相应目的序列（86bp ）的同源性检索和比对。结果证实所扩增片段系 BDV p24 基因片段，与人类基因组片段和其他病毒基因组片段无同源性，确定扩增成功。2.4 淋巴瘤患者及健康人 BDV p24 基因片段的检测每次
15、5 个梯度对照的阳性模板均扩增成功, 扩增曲线呈 S 形，阴性对照无荧光量改变，选取变异程度最小的 3 个阳性模板建立标准曲线，其相关系数均在 0.99 以上，接近 1，说明 ct 值和定量浓度对数值两者之间相关性好，定量较准确。20 例淋巴瘤患者与 20 例健康对照组样本检测 BDV p24 基因片段曲线部分为一直线，部分有少许荧光改变，但均在阈值线下方，说明淋巴瘤患者和健康人BDV p24 基因片段均为阴性。3 讨 论9恶性肿瘤的发生是多因素多阶段作用的结果，肿瘤发病机制中病毒学说已受到越来越多的关注。病毒感染可引起多种肿瘤发生4，有研究5提出 EB 病毒与血管免疫母细胞的淋巴瘤有密切关系
16、，并提出了相应的病原学证据；羊痘病毒和牛丘疹口炎病毒感染可诱发人类良性上皮瘤和组织细胞瘤；人类间皮瘤和脑肿瘤中存在猴病毒SV40 感染6；动物乳头瘤病毒-7 感染可致屠夫手疣，并有研究利用乳头瘤病毒属来制造抗肿瘤疫苗7。直到近年来才证明部分淋巴瘤确为病毒感染所引起8。人类淋巴瘤最早证实的是 Burkitt 淋巴瘤与 EB 病毒感染有关，认为该病是非洲儿童在婴幼儿期重度和持续 EB 病毒感染，免疫功能受到抑制，癌基因被激活，导致 B 淋巴细胞恶性增殖的后果9。早在 1987 年Gallo 等从 1 例蕈样霉菌病肿瘤组织中分离到 C 型 RNA 病毒，称之为 T 细胞白血病淋巴瘤病毒（HTLV-1） 。至今已有近十名 T 细胞淋巴瘤患者的肿瘤标本中分离到这种病毒，认为是一种高度特异性的病毒10。国外肿
