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1、专题2微生物的培养与应用 课题1微生物的实验室培养 微生物的类群 微生物 原核类 真核类 非细胞类 细菌 支原体 放线菌 蓝藻 个体微小 结构简单 酵母菌 霉菌 食用菌 真菌 原生生物 显微藻类 原生生物 如 草履虫 变形虫等 病毒 类病毒 朊病毒 微生物的共同特点 一 微生物基础知识 1 细菌的形态 几种菌落及其形态 几种菌落及其形态 4 病毒的结构 由核酸和蛋白质构成 病毒的结构 吸附 注入 合成 释放 组装 5 病毒的繁殖 病毒的增殖一般可分五个阶段 即 吸附 注入核酸 合成核酸和蛋白质 组装 释放 6 病毒的营养方式 寄生 微生物需要的五大类营养要素物质是 微生物需要的营养物质及功能
2、1 碳源2 氮源3 生长因子4 无机盐5 水 凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质 无机碳源 CO2 NaHCO3等 有机碳源 糖类 脂肪酸 花生粉饼 石油等 构成细胞物质和一些代谢产物 异养微生物的能源 概念 来源 作用 1 微生物的碳源 无机氮源 N2 NH4 NO3 NH3等 有机氮源 尿素 牛肉膏 蛋白胨 氨基酸等 凡是能够为微生物提供N元素的营养物质 主要用于合成蛋白质 核酸及含N的代谢产物 2 微生物的氮源 概念 来源 作用 3 生长因子 常见的生长因子 概念 作用 微生物生长不可缺少的微量有机物 酶和核酸的组成成分 维生素 氨基酸 嘌呤 嘧啶等 培养基 培养基 培养液 是由人工
3、方法配制而成的 专供微生物生长繁殖使用的营养基质 1 培养基的类型和用途 2 不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 参考教材附录内容 3 不管哪种培养基 一般都含有水 碳源 氮源 无机盐 等营养物质 另外还需要满足微生物生长对pH 特殊营养物质 例如 生长因子 即细菌生长必需 而自身不能合成的化合物 如维生素 某些氨基酸 嘌呤 嘧啶 以及氧气 二氧化碳 渗透压等的要求 培养基的种类 不加凝固剂 加凝固剂 如琼脂 工业生产 观察微生物的运动 分类鉴定 微生物分离 鉴定 活菌计数 保藏菌种 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 培养基成分明确 分类 鉴定 在培养基中加入某种化学物质 以抑制不需
4、要的微生物的生长 促进所需要的微生物的生长 培养 分离出特定微生物 在培养基中加入某种指示剂或化学药品 用以鉴别不同种类的微生物 鉴别不同种类微生物 选择培养基 液体培养基 半固体培养基 固体培养基 液体培养基 表面生长 均匀混浊生长 沉淀生长 back 半固体培养基 是否运动 无动力 有动力 弥散 固体培养基 菌落 分离导入了目的基因的受体细胞 几种选择培养基 加入青霉素的培养基 分离酵母菌 霉菌等真菌 不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基 back 血清中含有 多种蛋白质 白蛋白 球蛋白 铁蛋白等 多种金属离子 激素 促
5、贴附物质 如纤粘蛋白 冷析球蛋白 胶原等 各种生长因子 转移蛋白 不明成分 人工合成培养基只能维持细胞生存 要想使细胞生长和繁殖 还需补充一定量的天然培养基 如血清 无菌技术 1 无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中 所有防止杂菌污染的方法 消毒定义 利用化学或物理方法 杀死部份微生物的过程 2 消毒与灭菌的概念及两者的区别 灭菌的定义 以化学试剂或物理方法消灭所有微生物 包括所有细菌的繁殖体 芽孢 霉菌及病毒 而达到完全无菌之过程 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术 煮沸消毒法 100 煮沸5 6min 巴氏消毒法 70 75 下煮30min或80 下煮15m
6、in 化学药剂消毒法 用75 酒精 新洁尔灭等进行皮肤消毒 氯气消毒水源 紫外线消毒 消毒的方法 3 常用的消毒与灭菌的方法 灼烧灭菌 干热灭菌 160 170 下加热1 2h 高压蒸气灭菌 100kPa 121 下维持15 30min 灭菌的方法 最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌 它可以杀灭所有的生物 包括最耐热的某些微生物的休眠体 同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏 有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌 为了防止杂菌 特别是空气中的杂菌污染 试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口 通常采用棉花塞 也可采用各种金属 塑料及硅胶帽 它们只可让空气通过 而空气中的其他微生物不能通过 而平皿是由正反
7、两平面板互扣而成 这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的 二 实验操作 以培养大肠杆菌为例 制备牛肉膏蛋白胨培养基 1 计算2 称量3 溶化4 灭菌 将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅 在压力为100kPa 温度为121 灭菌15 30min 5 倒平板 待培养基冷却到50 左右时 在酒精灯附近倒平板 2d后观察平板 无杂菌污染才可用来接种 倒平板操作 纯化大肠杆菌 平板划线法和稀释涂布平板法 微生物的接种的常用接种方法有 1 平板划线的操作方法 平板划线的操作 一旦划破 会造成划线不均匀 难以达到分离单菌落的目的 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规则的菌落 菌落会沿着划破处生长 会形成一个条
8、状的菌落 2 稀释涂布平板的操作方法 4 菌种的保存 接种到固体斜面培养基 菌落长成后置于4 冰箱保存 3 微生物的恒温培养 长期保存 甘油冷冻管藏法 临时保藏 三 结果分析与评价 培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1 2d后无菌落生长 说明培养基的制备是成功的 否则需要重新制备 接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色 形状 大小基本一致 并符合大肠杆菌菌落的特点 则说明接种操作是符合要求的 如果培养基上出现了其他菌落 则说明接种过程中 无菌操作还未达到要求 需要分析原因 再次练习 是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不
9、同 及时观察记录的同学会发现这一点 并能观察到其他一些细微的变化 代谢类型 光能无机营养 光能自养型 光能有机营养 光能异养型 化能无机营养 化能自养型 化能有机营养 化能异养型 光 光 无机物 有机物 无机物 有机物 无机物 有机物 二氧化碳 二氧化碳及简单有机物 二氧化碳 有机物 大多数已知细菌和全部真核微生物 硝化细菌氢细菌 紫色非硫细菌 蓝细菌绿色硫细菌藻类 本课题知识小结 课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 一 课题背景 1 尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥 尿素不能直接被农作物吸收 土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用 2 细菌能利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素
10、是因为它们能合成脲酶 3 常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌 小球菌 假单胞杆菌 克氏杆菌 棒状杆菌 梭状芽孢杆菌 某些真菌和放线菌也能分解尿素 4 课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一 研究思路 筛选菌株 统计菌落数目 设置对照 1 实例 PCR技术 启示 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求 到相应的环境中去寻找 原因 因为热泉温度70 800C 淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来 DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制 PCR 的技术 此项技术要求使用耐高温 930C 的DNA聚合酶 筛选菌株 要分离一种微生物
11、必须根据该微生物的特点 包括营养 生理 生长条件等 方法 抑制大多数微生物的生长 促进目的菌株的生长结果 培养一定时间后 该菌数量上升 再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离 2 实验室中微生物的筛选原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件 包括营养 温度 pH等 同时抑制或阻止其他微生物生长 3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基 从物理性质看此培养基属于哪类 固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源 氮源 碳源 葡萄糖氮源 尿素 培养基的氮源为尿素 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 以尿素作为氮源 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素 缺乏氮源而不能生长发育繁殖 而受到抑制 所以用此培养
12、基就能够选择出分解尿素的微生物 5 培养基选择分解尿素的微生物的原理 允许特定种类的微生物生长 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 叫做选择培养基 尿素 尿素 6 怎样证明此培养基具有选择性呢 以尿素为唯一氮源的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 是 分离尿素细菌 判断该培养基有无选择性 只生长尿素细菌 生长多种微生物 是 1 显微镜直接计数 利用血球计数板 血细胞计数板 在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量 统计菌落数目 不能区分死菌与活菌 不适于对运动细菌的计数 需要相对高的细菌浓度 个体小的细菌在显微镜下难以观察 缺点 2 间接计数法 活菌计数法 原理 在稀释度足够高时 微生物在固体
13、培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的 即一个菌落代表原先的一个单细胞 常用方法 稀释涂布平板法 每克样品中的菌落数 C V M其中 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积 ml M代表稀释倍数 说明设置重复组的重要性 在设计实验时 一定要涂布至少3个平板 作为重复组 才能增强实验的说服力与准确性 在分析实验结果时 一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致 结果不一致 意味着操作有误 需要重新实验 注意事项 为了保证结果准确 一般选择菌落数在30 300的平板上进行计数 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中 经涂布 培养计算出
14、菌落平均数 统计的菌落往往比活菌的实际数目低 计算公式 每克样品中的菌株数 C V M 某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234 那么每克样品中的菌落数是 涂布平板时所用稀释液的体积为0 1ml A 2 34 108B 2 34 109C 234D 23 4 B 三 设置对照 判断培养基中是否有杂菌污染 将未接种的培养基同时进行培养 判断选择培养基是否具有筛选作用 完全培养基 营养成分齐全 接种后培养观察菌落数目 主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响 提高实验结果的可信度 实例 在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时 A同学从对应的106倍稀释的培
15、养基中筛选出大约150个菌落 但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落 分析其原因 原因 土样不同 培养基污染或操作失误 或者是混入了其他的含氮物质 小结 通过这个事例可以看出 实验结果要有说服力 对照的设置是必不可少的 方案一 由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养 作为空白对照 以证明培养基是否受到污染 结果预测 如果结果与A同学一致 则证明A无误 如果结果不同 则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题 实验设计 从肥沃 酸碱度接近中性的湿润土壤中取样 先铲去表层土3cm左右 再取样 将样品装入事先准备好的信封中 微生物的
16、天然培养基 一 土壤取样 数量最大 种类最多 大约70 90 是细菌 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌 二 制备培养基 由于初次实验 对于稀释的范围没有把握 因此选择了一个较为宽泛的范围 稀释倍数为103 107 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基 每个稀释度下需要3个选择培养基 1个牛肉膏蛋白胨培养基 还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管 将稀释相同倍数的菌液 在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目 因此 牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照 用来判断选择培养基是否起到了选择作用 应在火焰旁称取土壤10g 在稀释土壤溶液的过程中 每一步都要在火焰旁进行 分离不同的微生物采用不同的稀释度原因 不同微生物在土壤中含量不同目的 保证获得菌落数在30 300之间 适于计数的平板 三 样品的稀释 问题 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度 测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量 选用的稀释范围相同吗 原因 土壤中各类微生物的数量 单位 株 kg 是不同的 例如在干旱土壤中的上层样本中 好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万 放线菌数约为477万
