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1、韩朝伟 什么是DC 形态与功能 分化与成熟 DC体外培养 DC与肿瘤免疫 DC-CIK 对DC及肿瘤免疫的思考 什么是DC 树突状细胞（dendriticcells，DC）是目前所知的功能最强的 抗原提呈细胞，因其成熟时伸出许多树突样突起而得名。 抗原提呈细胞（antigen-presentingcell，APC）是指能工加 工、处理抗原并将抗原信息提呈给T淋巴细胞的一类细胞。 在机体的免疫识别、免疫应答与免疫调节中起重要作用。 根据APC表面膜分子表达的特点和功能的差异，可将APC分 为两大类：专职性APC和非专职性APC，其中专职性APC包 括树突状细胞、单核/巨噬细胞、B淋巴细胞。而非专
2、职性 APC抗原的处理和提呈功能较弱。 DC的历史 抗原提呈细胞摄入抗原并将其加工处理，被主要组织相 容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）捕 捉并以抗原肽-MHC复合物的形式表达于细胞表面，是激 活适应性免疫的基础，MHC分子在巨噬细胞和B细胞上 检测到表达，因此它们曾被认为是主要的抗原提呈细胞 ，但是Ralph Steinman的发现彻底颠覆了这一观点。 1973年至1980年，Steinman连续发表了一系列的论文，详 细报道了一类新的细胞的发现。 该类细胞归纳起来具有以下特点： 第一，该细胞存在于脾脏白髓质，在外周淋巴结和肠系淋巴结 中均
3、有发现； 第二，该细胞呈不规则形态，体积比T/B淋巴细胞大，缺少溶酶 体、高尔基体以及组织细胞具有的微丝管，最明显的是细胞向 四周伸出长短粗细不一的“伪足”； 第三，该细胞不分裂，不具备胞吞的能力； 第四，该细胞来源于骨髓而非胸腺，细胞表面高表达MHC分子 ； 第五，该细胞能引起强烈的混合白细胞反应，引起T细胞聚集， 促进T细胞活化与分裂，其效应比巨噬细胞或B细胞高几十甚至 上百倍。 根据这些特点，Steinman将这类细胞命名为树突状细胞（ dendriticcell，DC）并推测可能与抗原提呈有关。 Steinman的观点最开始受到广泛的质疑，但Steinman顶住 压力坚持了下来。随后的
4、10年时间里，DC被许多其他的 实验室观察到，并被证实以未成熟DC或前体细胞的形式 广泛存在于各种组织和器官中，尤其在皮下、粘膜层以及 血液中。这些细胞体积较小，缺少“伪足”，表达较低水平 的MHC分子，较高水平的Fc受体和补体受体，具有强烈的 吞噬能力，像“哨兵”一样实时监视着入侵宿主的病原微生 物。一旦检测到病原微生物，这些细胞立即启动吞噬和加 工过程，大量合成MHC分子，趋化因子受体，辅助激活因 子以及细胞因子，同时细胞启动成熟程序，体积增大，伸 出“伪足”，迁移至淋巴结或脾脏，激活适应性免疫。 2011年，Steinman因在“树状细胞及其在适应性免疫系统方 面作用的发现”，获得诺贝尔
5、生理学或医学奖。 形态与功能 DC因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名 功能最强的APC DC最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞增殖，而巨噬 细胞、B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞，因此DC是 机体免疫反应的始动者，在免疫应答的中具有独特地位。 DC对抗原和弱抗原都有很高的呈递效率，只需 少量的抗原及DC即可激活T细胞。 未成熟的DC可能诱导免疫耐受，体外激发混合淋巴细胞反 应（MLR）的能力较弱，但具有极强的摄取和加工处理抗 原的能力；成熟的DC能够诱导免疫激活，其抗原提呈能力 是巨噬细胞和B细胞的1001000倍，同时激发MLR的能力 很强，但抗原摄取能力大大下降。 未成熟DC
6、具有极强的内吞能力，通过膜皱缩和形成大囊泡， 形成液相内吞作用，可使极低浓度（1010mol/L）抗原得 到呈递，也可通过受体介导对糖基化抗原进行内吞。 在与T细胞的互动中，除提供MHC类分子/肽复合物的第一 信号外，还高表达B7-1、B7-2、CD40分子，为T细胞提供充 足第二信号，来促进T细胞的激活。 DC还可以增强体液免疫：一方面，DC通过促进抗原特异性 CD4+Th的产生，促进抗体生成；另一方面，DC直接作用于 B细胞，促进免疫球蛋白的分泌。 分化与成熟 DC的产生分两个阶段：从祖细胞分化为未成熟DC和未成 熟DC受外界刺激分化成熟。 DC的分化体内DC起源于多能造血干细胞，按来源其
7、分化 途径分为两条：髓系分化途径。称为髓系DC，最终分 化为朗格汉斯细胞和间质DC两个亚群；淋巴系分化途 径。为淋巴系DC，最终分化为类浆细胞DC。 髓系DC的分化发育分为4个阶段：前体阶段、未成熟DC、 迁移期和成熟DC，不同分化阶段的DC功能不同。DC前体 经血循环进入非淋巴组织，分化为未成熟DC，未成熟DC 具有很强的摄取、处理和加工抗原的能力。DC在摄取了 抗原后迁移到次级淋巴组织，在此过程中DC也随之成 熟。 正常情况下，体内多数DC处于未成熟阶段，其广泛分布 于全身各外周组织，高表达吞噬相关受体，而不表达或 低表达共刺激分子和黏附分子。 未成熟DC有较强的抗原内吞和加工处理能力，而
8、激发混 合淋巴细胞反应能力较弱。经过抗原摄取、炎性因子活 化等一系列过程，DC由未成熟转变为成熟，成熟DC则高 表达MHC类分子、共刺激分子和黏附分子，CD83、 CD25为成熟DC的特征性标志。 成熟DC的抗原呈递能力及体外激发混合淋巴细胞反应的 能力强，而抗原摄取能力弱。DC的成熟过程同时伴有迁 徙，在外周组织中摄取抗原后，通过延长树突状突起， 改变趋化因子受体表达等方式进入淋巴结及淋巴管中成 熟，并激发T细胞反应。 未成熟DC与成熟DC的比较 未成熟DC和成熟DC在形态学、表型等方面都有很大的不 同。 形态学方面，未成熟DC呈葡萄串样半贴壁生长，细胞表面 褶皱多，毛刺样突起少；成熟的DC
9、集落分散，悬浮生长， 细胞边缘有明显的毛刺样突起。 表型方面，未成熟的DC仅表达低水平的MHC分子、协同刺 激分子（CD80、CD86）和黏附分子（CD40、CD44、 CD54）等；成熟DC则表达高水平的MHC分子、协同刺激 分子和黏附分子、整合素（1、2）及特征性标记（CDla 、CD11c、CD83）等，并能分泌IL-12、IL-2l、IL-26、IL- 28、肿瘤坏死因子-（TNF-）、IFN-等细胞因子。 DC体外培养 目前DC多来自骨髓或外周血CD34+造血祖细胞、外周血 DC及单核细胞，其中以单核细胞来源的DC应用最广。 获取DC的方法有： 将来源于骨髓或外周血CD34+造血祖细
10、胞在体外与GM -CSF和肿瘤坏死因子共同培养，获得大量DC。 单核细胞在GM-CSF和IL-4共同作用下诱导分化为未成 熟DC，并在外来因素刺激下进一步分化为成熟DC。 Flt3配体能动员DC进入外周血，显著增加外周血中DC 的数量，进而直接从外周血中分离纯化到大量DC。 单核细胞培养DC的过程 1.PBMC的分离 静脉采血40ml，以2：1体积比加于用淋巴细 胞分离液液面，离心分离PBMC，500g，20min。 小心吸取富含单个核细胞的细胞层，以1：5体积比，用RPM1- 1640洗涤细胞三次：650g，10min；300g，10min两次。 2.MCM的制备 IgG包被培养皿：取6ml
11、10mg/ml人IgG加入 10cm的培养皿，静置1h后吸尽液体，用RPMI-1640洗平板两 次。 将上述方法分离所得PBMC5107/8ml，加入平板，37静置2h ，洗去非贴附细胞，再加入8mlRPMI-1640，37，培养24h。 离心收集培养液，0.2m滤头过滤，分装，-20保存备用，工 作浓度25%。 3.DC的培养 用RPM1-1640重悬细胞，调细胞密度为 1106/ml，加入12孔板，每孔4106，37静置2h，轻轻吹打 ，悬浮非贴壁细胞，弃去。 再用预热的RPM1-1640轻洗培养板两次，部分标本用75cm2培 养瓶过夜培养或4低温培养液收集悬浮细胞，再转入24孔板 培养（
12、间接贴壁）。 加入含10%FCS完全培养基，2-巯基乙醇（浓度为510-5M） ，rhIL-4，rhGM-CSF各1000U/ml，37，5%CO2，培养57d 收获未成熟DC。 部分培养自第7d始加入单核细胞条件性培养液（MCM）或 TNF-（100Ug/ml）第1114d收获成熟DC。 DC与肿瘤免疫 人体的抗肿瘤免疫流程：肿瘤相关抗原的摄取与呈递 ；激活肿瘤相关抗原特异性T细胞；引导肿瘤相关抗 原特异性T细胞至肿瘤部位，杀灭肿瘤细胞。 机体抗肿瘤免疫主要依靠细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）的免疫应答来杀伤肿瘤细胞，CTL并 不能识别完整的肿瘤抗原分子
13、，只能特异性地识别来源 于肿瘤抗原亲本、由MHC分子呈递的抗原多肽。在大部 分恶性肿瘤中，肿瘤细胞表面的MHC抗原肽、共刺激分 子和黏附分子表达较低，不能有效地诱导T细胞活化，故 需要抗原呈递细胞的协同作用。 DC可以通过多种机制发挥其抗肿瘤免疫作用。 (1)激发细胞免疫。在肿瘤患者体内,DC可以直接向CD8+T 细胞提呈肿瘤抗原,诱导CTL反应。 (2)激发体液免疫。一方面,DC可以促进抗原特异性CD4+ 辅助性T细胞(helperTcells,Th)的产生,启动CD4+Th11668相 关免疫应答;另一方面,DC还可直接作用于B细胞从而促进 免疫球蛋白的分泌。 (3)自分泌或诱导其他细胞分
14、泌多种细胞因子或趋化因 子。 (4)DC可以与肿瘤细胞直接接触而抑制其生长。 (5)肿瘤抗原致敏的DC可释放一种具有抗原提呈能力的囊 泡小体,该小体内含有大量MHCI、II类分子和共刺激分子, 能显著刺激抗原特异性CD8+T细胞增殖,并诱导抗原特异 性CTL反应。 肿瘤微环境 虽然DC有强大的抗肿瘤作用,但实际在患者体内的效果却 不尽如人意,这可能与肿瘤的微环境诱导了免疫耐受的出 现有关。 肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展过程中扮演了重要角 色。由于肿瘤细胞、免疫细胞及其他间质细胞相互作用, 并产生多种免疫抑制性因子,从而营造了免疫抑制性肿瘤 微环境,抑制机体的免疫系统,促使肿瘤细胞逃逸机体的免
15、疫监控,最终导致肿瘤的生长和转移。肿瘤微环境能够影 响DC的募集、分化、成熟和生存,抑制DC提呈抗原和激 活T细胞,造成宿主免疫系统对肿瘤抗原的无应答从而发生 免疫耐受。在这些机制中,调节性T细胞(regulatory Tcells,Treg)及JAK2/STAT3通路起到了重要作用。 调节性T细胞 调节性T细胞是一类具有免疫负调控功能的T细胞亚群，该类 细胞通过细胞直接接触和分泌调节性细胞因子发挥抑制效应 ，逃避自身免疫反应，从而使少量的恶变细胞逃避免疫监视 和免疫防御，导致肿瘤的发生发展。有研究发现，肿瘤患者 外周血中的CD4+CD25+调节性T细胞明显增多，而且 CD4+CD25+细胞水
16、平越高，预后越差。CD8+CD28-T细胞是 近年来被证实的另一种重要的调节性T细胞，这种T细胞在肿 瘤患者的外周血中也大量增多，体内外实验均证实，其具有 较强的免疫抑制作用，可抑制机体产生保护性抗体。然而， 完全清除具有免疫抑制作用的调节性T细胞会引起各种严重 的自身免疫反应。因此，纠正患者机体内环境的免疫失衡， 降低肿瘤患者体内调节性T细胞水平，保持机体免疫稳态， 是治疗肿瘤的关键之一。 DC-CIK DC细胞可有效地诱导静止T细胞增殖和应答，促进细胞毒性T 细胞和辅助性T淋巴细胞的生成，启动并参与免疫应答。同时 还是CD8+CTL和CD4+T细胞介导的原发性和继发性免疫反应 的最强的激发者，可有效地抑制肿瘤逃逸。CIK细胞兼有T淋 巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞MHC限制性杀瘤的特 点，是一种体外增殖能力强、杀瘤活性高的广谱抗瘤免疫活 性细胞。在杀伤肿瘤细胞、调节机体免疫功能方面有一定的 效果，能一定程度上降低肿瘤复发和转移。 C
