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1、word格式中央民族大学生命与环境科学学院生物化学实验综合性设计实验报告牛血中SOD分离纯化及含量、活性、相对分子质量的测定The separation, collection, purification and identification of SOD from the cow blood姓 名：唐胜华 学 号： 0941063 年 级： 09生科 专 业： 生物科学 小组成员： 韩旭思 关晴月 指导教师： 刘立亚 2011年12月17日牛血中SOD分离纯化及含量、活性、相对分子质量的测定 唐胜华 韩旭思 关晴月 （中央民族大学 北京市 100081）摘要：目的 熟练掌握从动物血液中提取S
2、OD及分离鉴定和活力测定。方法 破碎细胞释放其中的内涵物，有机溶剂去除血红蛋白，再用透析法纯化所得SOD，然后根据SOD的物理化学性质进行各项指标测定。结果 实验中SOD在限制邻苯三酚自氧化的用量时随着提取纯化次数的增加而增加，PAGE电泳胶块染色和脱色后可以明显的发现胶块正中央有透明区域。结论 动物血液中含有，它具有抑制氧化作用的功能。关键词：SOD，邻苯三酚自氧化，电泳，抑制氧化。Theseparation,collection, purification and identification of SOD from the cow blood TANG Sheng-hua， HAN Xu
3、-si, GUAN Qing-yue (MinZu University of China, City of Beijing,100081)Abstract: Objective From the experiment, we can know exactly how to get SOD from cow blood, then separate, collect, purify and identify it. Methods we start on determining the feature of SOD after extracting, separating, and colle
4、cting it, then we will get what we want from the experiment. Results through the experiment, obviously that the amount of Pyrogallol used to suppress the Oxidation rate is increased with the steps to separate, collect, purify the SOD increasing. Also we can find that there is a Transparency in the m
5、iddle of the Rubber block after the Electrophoresis finished. Conclusions Through the experiment, we deeply know that there is always some SOD in the animal blood which itself can suppress the Oxidation rate in the body.Keywords:SOD, self-Oxidation of Pyrogallol, PAGE Electrophoresis, Oxidation-supr
6、ession前言近年来，随着生物科学领域中分子生物学的迅速发展，使得之前只能从细胞层面研究血液组成及功能的瓶颈得以突破，进入研究血红细胞中分子组成的层次。由此，在大量实验中都存在着这么一种现象，红细胞中有某种组成成分能够抑制生物自氧化的速率，延缓细胞衰老和凋亡的时间。通过大量的实验证明，这种物质就是超氧化物歧化酶（又称SOD），是一种能专一地清除超氧阴离子自由基(O2)的金属酶。按所含金属离子不同可分为CuZnSOD、MnSOD 和FeSOD。SOD催化反应：2H+2O22H2O2+O2。SOD对过量的O2的及时清除保证了机体内O2的含量相对平衡，对机体起防护作用。国内外研究表明SOD具有抗炎
7、、抗衰老抗辐射等重要作用。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关进展报道。许平、袁艺、赵文芝、余旭亚等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取出SOD并进行相关研究。其提取方法因原材料的不同而不同，本实验通过对牛血红细胞中SOD的研究，证明SOD的生理作用以及影响其活性的因素，从而从更深层面上认知SOD的生理生化作用。1.材料和方法1.1实验材料与试剂新鲜牛血液（含有柠檬酸钠抗凝剂）1.1.1实验试剂0.6%的TritonX-100溶液，0.9%的生理盐水，4下预冷的95%乙醇，4下预冷的氯仿，丙酮，蒸馏水，2.5mmol/LpH7.6磷酸钾缓冲液，0.05mol/L邻苯三酚，10mmol/L
8、的HCl溶液，考马斯亮蓝R-250试剂，100mg/mL的标准蛋白溶液。1.1.2电泳试剂PAGE电泳试剂：2.45*10-3mol/L NBT溶液，3.60*10-2mol/LpH7.8的磷酸缓冲液，5*10-2 mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液，40%蔗糖，0.14%过硫酸铵(AP)，20%的乙醇，7%的冰乙酸的水溶液，0.5mol/LNaCl水溶液，0.25%的考马斯亮蓝R-250染色液，含有50%乙醇和10%的冰乙酸的水溶液，浓缩胶缓冲液，分离胶缓冲液，样品溶解液，1*电极缓冲液，10%的（m/V）SDS贮液。1.1.3实验仪器10mL、25mL量筒各两个，烧杯，10mL的小试管10
9、支，玻璃棒，冰箱，恒温水浴箱，10000道尔顿的透析袋，离心机（10、50mL的离心管），移液枪（10uL、50uL、200uL、1000uL）和对应枪头各一套，25mL、50mL、100mL容量瓶各一个，721分管光度计一台，垂直板电泳槽。1.2实验方法1.2.1牛血液中SOD的提取与分离纯化沉淀红血球：取配好的牛血液200mL(7份血液：1份柠檬酸三钠)，装入4个50mL的离心管中，,以4000r/min离心处理10min，吸除上清液( 血浆)，收集下层红血球沉淀约100mL。低渗涨破细胞：把收集的血球加等体积0.9%的氯化钠溶液, 以4000r/min离心处理10min,重复3 次,得洗
10、涤红血球。然后在洗净的红血球中加入等体积0.6%的tritonX-100溶液，在40C条件下,搅拌溶血30min,在040C下放置30min以上,使红血球充分破裂。沉淀血红蛋白：按溶血体积的0.25倍缓慢加入预冷至40C的95%乙醇, 再按溶血体积的0. 15倍加入预冷至40C的氯仿, 搅拌15min,静置30min,4000r/min离心处理10min,收集上清液,弃去沉淀物（留样3.0mL测酶活，蛋白质浓度及电泳鉴定）。SOD的再提纯：在上清液中加入K2HPO4.3H2O(43gK2HPO4.3H2O：100mL上清液)，充分搅拌，转移至分液漏斗，振摇后静置15min，室温下4000r/m
11、in离心10min，见明显的分层，收集含有SOD的上层乙醇-氯仿相（微显浑浊），室温下4000r/min离心20min，弃去沉淀，收集上清液约60mL（留样3.0mL测酶活，蛋白质浓度及电泳鉴定）。沉淀SOD：像上一步得到的上清液中加入0.75倍体积40C预冷过的丙酮，出现SOD沉淀，室温下4000r/min离心20min收集灰白色的沉淀物。溶解沉淀：把沉淀物用2 倍蒸馏水溶解,在65 0C的水浴中保温15min,迅速冷却至室温,4000r/min离心10min收集上清液,弃去沉淀物（留样1.5mL进行酶活和蛋白质浓度测定及电泳鉴定）。透析纯化：将剩下的溶解液，装入截留量为10000道尔顿的透
12、析袋中，40C条件下于200mL浓度为2.5mmol/L pH值为7.6的磷酸缓冲液中透析，每隔0.5h换透析液一次，总共进行4次，若有沉淀，则4000r/min离心30min，弃去沉淀物，收集上清液（留样0.5mL测定酶活，蛋白质浓度及电泳鉴定）。1.2.2邻苯三酚法测定SOD活性，用分光光度计在波长为325nm下测其OD值邻苯三酚的自氧化率测定：取两支试管按下表1加入缓冲液（50mmol/LpH为8.2的Tris-HCl），于25oC保温20min，然后加入25oC预热过的邻苯三酚液，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325nm波长下测定A值，于恒温池中每隔30s侧吸光值一次。计算线性
13、范围内每1min吸光的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在正好0.070 A/min左右。注意，空白对照用10mmol/L的盐酸代替邻苯三酚。 表1.邻苯三酚自氧化速率测定加样表 Table 1 The table of how to add the Sample 试剂 空白管 自氧化管pH8.2的Tris-HCl缓冲液（mL） 4.5 4.510mmol/L的HCl（uL） 170 45mmol/L的邻苯三酚（uL） 170酶活性测定：按照下表2要求加样，测定操作同邻苯三酚自氧化速率相同，根据酶活性情况可以适当调整样品液加入量。 表2.酶活性测定加样表 Table 2 The table for how to add Enzyme 试剂 对照管 实验管pH8.2的Tris-HCl缓冲液（mL） 4.5 4.5 酶溶液（uL） - 4045mmol/L的邻苯三酚（uL） - 170 10mmol/L的HCl（uL） 170 -酶活力计算：在规定
