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1、本科毕业论文（设计）题 目转基因蓝色茧研究 学 院_生物技术学院_ 专 业 _ 蚕 学_ 年 级 _ _ _ 学 号 _姓 名 _ _ 指 导 教 师 _ 成 绩 _ 2011年4月20号2目录文献综述21 转基因家蚕研究进展21.1 机械方法21.2 基因打靶32 彩色茧相关研究进展32.1 我国的彩色茧品种资源32.2 彩色茧丝的特性42.3 彩色茧丝的开发利用现状4引言41 材料与仪器51.1实验材料：51.2 实验试剂：51.2.1家蚕基因组DNA提取所需试剂51.2.2基因扩增及克隆用试剂51.3 实验仪器：62 实验步骤：62.1目的基因的合成62.2 载体的构建62.3目的片段与
2、载体的连接62.4感受态细胞的制备72.5重组质粒转化大肠杆菌72.6 阳性克隆的筛选和验证82.7 转基因家蚕系的建立82.7.1 注射质粒的提取82.7.2 载体导入家蚕受精卵82.7.3 荧光筛选83 结果与分析93.1构建成功的质粒93.2 阳性质粒的验证93.3 荧光筛选结果93.4 G1代饲养结果103.5 再验证103.5.1 家蚕G1代基因组DNA的提取113.5.2 PCR扩增体系113.5.3 反应参数113.5.4 片段回收123.5.5 回收后片段的T克隆123.5.6 测序124 结论与讨论124.1目的基因可能已表达124.2 目的基因可能未表达124.3 实验总结
3、13参考文献：13致谢：14转基因蓝色茧研究黄诗健西南大学生物技术学院，重庆 400715摘要：随着消费水平的提高，彩色茧丝日益受到人们的青睐。然而，天然彩色茧丝容易掉色，再加上产量低，颜色单一，色泽又不纯正，一般很难得到普及。本实验的目的是期望获得一种更具优势的有色品种，主要通过构建pBacFib-HP3-BFP-LBS 表达载体，利用家蚕转基因技术，将外源基因BFP蓝色荧光蛋白基因导入家蚕受精卵内，经过荧光筛选获取转基因家蚕系。 实验成功构建了pBac最终表达载体，获取了家蚕转基因系，但是目的基因的性状最终未能表现。本课题的研究是继绿色茧、红色茧之后的又一次尝试，为转基因彩色茧系的进一步完
4、善做出了努力。关键词：转基因；蓝色荧光蛋白；彩色茧Research of blue transgenic cocoon HUANG ShijianBiotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, ChinaAbstract: With the consumer level,color silk increasingly popular from people. However, the natural color silk easy to fade, along with low output in color, not pure c
5、olor, generally is difficult to get popular. The purpose of this study is to expect a more dominant colored varieties, mainly by building pBac Fib-H P3-BFP-LBS expression vector, the use of transgenic silkworm technology, the foreign gene BFP blue fluorescent protein gene into silkworm fertilized eg
6、gs, after a fluorescent screening for transgenic silkworm system. PBac constructed successfully the final expression vector, transgenic lines for the silkworm, but not the final target gene expression traits. Research of this subject is the second green cocoon, attempt again after the red cocoon, th
7、e cocoon of transgenic lines of color have made efforts to further improve.Key words: transgenic;BFP;cocoon color文献综述二十一世纪是生命科学的世纪，生物学技术的发展使得家蚕作为模式生物的地位日益显现。转基因技术是指将某些外源基因转入到另一段基因序列中，再注入细胞或生物体内，使得重组的基因组得以表达，从而获得原来不曾有的某些性状和优势。转基因动物1被认为是遗传学中继连锁分析2、体细胞遗传和DNA重组之后的第四代技术。将转基因技术运用到家蚕身上，可谓是时代的召唤。在未进行转基因之前，家
8、蚕的资源可谓相对稀少，为了克服遗传壁垒，往往不得不收藏大量的家蚕种苗，这在一定程度上造成了人力、物力、财力等诸多方面的浪费。利用转基因技术，可以改良蚕品种，创收经济性状更具优势的新品种。1 转基因家蚕研究进展家蚕是研究真核生物基因的比较得力的材料。中国饲养家蚕的历史久远，遗传基础又很明确，把家蚕作为研究材料，利用生物科学技术，探究生命体基因的完整构架、作用及其表达调控，比运用其他生物更具优势；与原核生物相比，作文真核生物的家蚕，其生物反应器3有着不易逾越的优点：由于外源基因在家蚕体内的高效的表达，加上丝蛋白的转化率高，利用转基因技术饲养家蚕已经成为获取高性状茧丝的不二之选；除此之外，转基因技术
9、4如果运用到家蚕育种方面，可以改变育种周期，按照人们的目的进行优化生产，为茧丝高效优质的提供更多可能。1.1 机械方法机械方法，顾名思义，就是通过一系列物理手段将一段基因序列转入一细胞或生物体中。在目前所有转基因技术中，原核注射5是被认为最可靠的一种，但存在整合效率低、不能定点整合、设备昂贵等缺点。对于家蚕转基因而言，多用显微注射法。在家蚕上应用以钨针携带外源基因然后扎入卵内并注射进去的方法是显微注射。优点是操作简便，设备简单，成本低，但由于不能很好的掌握针尖进入卵的深度，可能发生外源基因达不到卵核或将卵穿破的情况，处理后的卵孵化率低外源基因随机插入染色体，有时发生多拷贝插入，对其表达和检测有
10、影响。除此之外还有许多方法，如基因枪导入法6、压力渗透法等。基因枪法是利用钨弹携带外源基因，然后高速轰击蚕卵，以达到把外源DNA射入的目的。压力渗透法7也是非常实用的方法，即首先配置一定浓度的外源DNA溶液，接着将蚕卵浸入到其中，然用真空泵抽出空气，再慢慢的导入空气如此重复多次，气压的变化使得蚕卵的卵孔打开，外源DNA在压力的作用下便可顺利的通过卵孔进入蚕卵。1.2 基因打靶基因打靶技术8是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而
11、可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。2 彩色茧相关研究进展2.1 我国的彩色茧品种资源我国的彩色茧9品种主要分为两大类，即黄红茧系和绿茧系，包含了碧连、大造、绵阳红等品种。黄红茧系主要是由金黄、淡黄、肉色、锈色、红色等构成，绿茧系就只有淡绿和绿色两种。蚕茧颜色的主要来源是桑叶，黄红茧系的茧色来自桑叶中两种类萝卜素，即胡萝卜素和叶黄素。绿茧系的茧丝色主要为黄酮类色素，这些色素首先在幼虫消化管内形成，然后转移至血液，最后透入丝腺。蚕茧的颜色主要集中在丝胶，其差异性较大，除了
12、内外层均含有颜色的蚕茧外，还存在只有内层或外层有色的蚕茧。蚕茧颜色深浅不仅与色素的成分和含量有关，而且受消化管与绢丝管壁的渗透性影响，即受到基因的控制。2.2 彩色茧丝的特性 绢丝昆虫10所吐的丝颜色繁多，性状也丰富多样，利用家蚕转基因技术可以研发出更多的品种，从而适应社会发展的需要。家蚕彩色茧丝的遗传受主基因控制，使彩色茧生产品种的特性能够稳定地固定，给育种和生产创造了良好条件。彩色茧家蚕虽然单茧小，但发育经过短食桑量也少，单位桑田和单位劳动力收获的蚕茧量不会比饲养白茧少。加上彩色茧家蚕品种一般体质强健，因此彩色茧家蚕品种的农村生产优势明显。 2.3 彩色茧丝的开发利用现状 天然彩色丝11是
13、一种绿色产品，对减少环境污染，促进人类健康非常有利。目前，天然有色茧丝市场很大，往往呈现供不应求的现象，黄色野蚕丝的价格是白色丝的3-30倍，足以说明这个紧缺问题。因此，选育彩色茧实用品种，并及时将其进行推广普及，此过程中产生的商业利益是不可小觑的。 引言随着彩色茧丝在市场上越来越受欢迎，生产天然无害的有色茧已成为当务之急。通过多年的研究，我国掌握了获取转基因绿色茧的技术，但很明显，单一的绿色茧用于生产时会显的很无力。为了壮大转基因有色茧的家族，必须要其它成员的加入。本实验的设计，就是为了获取转基因蓝色茧，具体构架是这样的：首先要获得目的基因序列BFP，并且建立相应的基因载体，把重组的DNA注
14、入感受态细胞，置于培养基内，在适宜的环境下使其成长。进行阳性检测后，选择合适的质粒通过显微注射的方法导入家蚕受精卵，G0进行自交或回交制种，对G1荧光筛选，获取相关数据，进行实验分析。本实验的若能得以顺利进行，在一定程度上对家蚕转基因技术的完善起到了促进和完善作用，同时对工业生产技术的成熟起到了催化的作用。1 材料与仪器1.1实验材料：家蚕品种：实验所用的家蚕品种为碧波（BB），由西南大学家蚕基因资源库提供。菌株和质粒：宿主菌DH5菌株、pBac3xP3-DsRedaf载体、pSL-HAL载体；质粒pUC57-TagBFP由金思特公司合成。1.2 实验试剂：1.2.1家蚕基因组DNA提取所需试
15、剂液氮、平衡酚（Tris饱和）、1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）、0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）、 TE（PH8.0）、10mol/L CH3COONH4 、70% 乙醇、20mg/ml 蛋白酶K、10mg/ml RNA酶。抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）；0.1 mol/L EDTA（pH 8.0）；0.5% SDS。加样缓冲液：0.25%溴酚蓝；0.25%二甲苯青（FF）；15%聚蔗糖水溶液。1.2.2基因扩增及克隆用试剂ExTaq DNA聚合酶、LATag DNA聚合酶、2.5mM dNTP、10PCR buffer、2.5mM Mg2+、DNA marker、10loading buffer、各种限
