《猪细小病毒ppvsc1株的分离鉴定(1)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪细小病毒ppvsc1株的分离鉴定(1)（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2 7 2中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2 0 0 6 年学术研讨会论文集 猪细小病毒( P P V ) S O l 株的分离鉴定 殷华平，罗燕，郭万柱* ，徐志文 ( 四川农业大学动物生物技术中心，雅安四川，6 2 5 0 1 4 ) 摘要：从四川部分猪场采集的流产、死胎中分离出了一株病毒该病毒能够在S T 、I B R S 一2 和P K 一15 细胞上生长并引起明显的呈拉网状和细胞脱落的细胞病变。病毒能够凝集0 5 鬈的豚鼠红细胞；荧光抗体染色 可见细胞内出现明显的荧光。电镜观察可见大4 、约为2 2 n m 的无囊膜的病毒粒子。采用特异性P P VN S l 基因 的引物得到了大
2、小约为2 2 k b 的片段，经测序井经序列比较鉴定该病毒为猪细小病毒，命名为P P V - S C l 。 关犍词：猪细小病毒；P P V - S C I ；分离；鉴定 猪细小病毒( p o r c i n e p a r v o v i r u s ，P P 为引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，可引起胚胎或，和胎儿的 感染和死亡，导致母猪发生流产、死胎、胎儿术乃伊化及新生仔猪的死亡。本病最早发生于欧洲一些 国家，后发展到北美洲、亚洲、南美洲、非洲及太平洋洲。现在世界许多国家和地区均有流行。张 代荣等( 2 0 0 2 ) 对四川省部分种眚( 猪) 场共5 5 2 份血清进行了猪细小病毒抗体检
3、测，结果平均阳性率 为5 2 ，最高可达9 3 。可见P P V 在我国广泛地流行，对畜牧业的发展起着重要的影响本文从四川部分 猪场采集到的流产、死胎中分离出了一株猪细小病毒，为今后进行猪细小病毒的诊断、预防和控制打 下了基础。 1 材料与方法 1 1 实验材料 P K 1 5 、I B R S 2 和S T 细胞及P P V 血清和兔抗P P V 荧光抗体由四川农业大学动物生物技术中心提 供；豚鼠购于华西医大实验动物中心。 1 2 实验方法 1 2 1 病料的处理按参考文献无菌采取四川部分猪场初产母猪的流产胎儿、木乃伊胎的实质器官 心、肝、脾、肺、肾进行处理。 1 2 2 病毒的分离培养处理
4、好的病料在细胞传代的同时，或者待细胞长满细胞瓶的l ，3 后时，进行 接种，3 7 培养，观察3 - 6 天，待细胞出现病变后，收冻。如3 - 6 天后还未出现病变，再盲传3 代， 若无病变则弃之。 1 2 3 血凝及血凝抑制实验”1 。 1 2 4 免疫荧光实验“。进行免疫荧光的榆测，同时做阴性正常细胞对照。 1 2 5 病毒的电镜观察”l 。将细胞培养物用醋酸铀和柠檬酸铅染色后观察。 1 26 病毒非结构N S l 基因的扩增鉴定“。根据P P V N A D L - 2 株的全基因序列没计一对引物，上漪为P l ： 5 G T C G A A T T C A G C A T G G C
5、A G C G G G A A A C3 ，下游引物为P 2 ：5 T C G A A G C T r C T G C G G C G T AT G G A T 3 ，预计扩增的片段大小约为2 2 k b 。P C R 反应体系采用5 叫l 体系：1 0 xb u f f e r5 1 a l ，d N T P ( 各2 5 m m 0 9 1 ) 4 a l ， P 1 ( 2 5 a m o l 1 ) 2 a l ，P 2 ( 2 5 p m o l 1 ) 却l ，M g C l 2 ( 2 5 m m o V l ) 3 M I ，模板5 9 l ，T a qD N A 聚合 晦(
6、5 U p 1 ) t p l ，补水至5 0 p l 。 基金项目：刚川省科技厅应用基础项目( 0 3 J Y 0 2 9 0 3 5 2 ) 资助。 作者简介：殷华平( 1 9 7 7 ) ，男，o a J I I 广安人，o f l 农业大学在滨博上，主要从事传染病病原分子生物学研究。 + 通讯作者：郭万柱E _ m a i l ：w z g u o 1 2 6 c o m 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2 0 0 6 年学术研讨会论文集2 7 3 混匀后在P C R 仪上反应：9 5 1 0 m i n ；9 4 3 0S ，5 5 3 0 S ，7 2 1 2 0 S ，3 2
7、 个循环；7 2 延伸1 0m i n 。 同时做正常的s T 细胞D N A 对照。将P c R 产物直接送宝生物公司测序进行鉴定，并与P P VN A D L - 2 莆毒 的序列进行同源比较。 2 结果与分析 2 1 病毒的分离 从1 5 份病料中分离出了1 株病毒，命名为P P V - S C l 。病毒在猪肾传代细胞P K - 1 5 、I B R S 一2 及猪 睾丸传代细胞s T 上传代后均能出现细胞病变( C P E ) 。接毒2 _ 4 天后可明显见到规律性的细胞病变 ( C P E ) ：培养细胞出现弥散性颗粒，胞浆收缩，细胞变圆，有的细胞m 现细胞间的融合、聚集现象或者
8、呈拉刚状，最后病变细胞开始崩解脱落，出观空斑( 病变如图1A 、B 、C ) 。 ABC 图1 ：感染P P V S C l 的P K l 5 ( A ) 、I B R S - 2 lB ) 和S T ( C 】细胞 F i g 1P K l 5 ( A ) 、I B R s 一2 ( B ) 和s T ( c ) c d l l i n e si n o c u l a t e d b yp p v s c l 2 2 病毒的鉴定 2 2 1 病毒的血凝和血凝抑制实验病毒的细胞培养物在4 下能够凝集豚鼠的红细胞，并具有较高 的血凝效价。其血凝实验结果如表1 、2 。 表1 病毒的血凝实验 T
9、 a b l e lH A t e s t o f t h ev i e s 分离的病毒的血凝价为1 ：2 ”，4 单位的病毒血凝价为1 ：2 8 。该分离的病毒能够被特异性兔抗 P P V 阳性血清所抑制，经测定其血凝抑制效价为1 ：2 9 ，结果如下： 表2 病毒的血凝抑制实验 T 曲l e 2 t e s to ft h ev i r e s 2 2 2 免疫荧光实验间接免疫荧光染色可见特异性荧光，呈苹果绿色，分布于细胞核和细胞质中， 对照均无特异性荧光。结果如图2 。 2 7 4 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2 0 0 6 年学术研讨会论文集 图2 ：P P V - S C l
10、 的荧光染色 F i g 2P P V - S C Ii m m u n o f l u o r e s c e n tA s s a y 图3 ：P P V S C l 电镜图 F i g 3 E l e c t r o n m i c r o s c o p e o f P P V - S C l 2 2 3 病毒的电镜观察将细胞适应毒做超薄切片于电镜下观察，可以在细胞核内见到圆形，无囊膜， 大小约2 3 n m 的病毒粒子，同时在细胞核内可见到大量的病毒包涵体，有的病毒粒子正从包涵体中释 放成熟。病毒的电镜结果如图3 。 2 2 4 病毒非结构蛋白N S l 基因的扩增和序列鉴定以提取的
11、P P V - S C I 病毒基因组复制型D N A 为模 板，P 1 和P 2 引物对扩增出了大小约为2 2 k 的条带，结果与预期的大小一致，而正常对照细胞中未扩 增出2 k b 的目的条带。扩增产物的电泳结果如图4 。 图4P C R 扩增P P V - $ C lN S l 基因电泳图 F i g 1P C Ra m p l i f i c a t i o no ft h eP P V S C lN S lg e n e A ：M a r k e rn D N A H i n dI I I ) ； B ：P P V S C lN S l ： 将经酶切鉴定的阳性重组质粒p P N S
12、lJ 越L 物公司测序，测序结果得到了与预期一样大小的2 2 k b 序列。将测得的序列递交N C B I ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ) i 云行B L A S T n 进行比对，结果与P P VN A D L - 2 有9 9 以上的同源性。因此测得的序列猪细小病毒N S I 基因的序列。 3 分析与讨论 本次实验将采集到的部分初产母猪的死胎病料接种于猪肾细胞P K 一1 5 ，发现能明显引起细胞出现稳 定的细胞病变，我们根据细小病毒的特性分别做了部分病毒学的鉴定，然后结合实验室诊断技术进行 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2
13、0 0 6 年学术研讨会论文集 2 7 5 了血凝和血凝抑制实验、电镜实验、免疫荧光实验基本鉴定了该株病毒为猪细小病毒。为了进一步证 实结果的正确性，接着进行了分子生物学方面的鉴定工作。据报道，几种脊椎动物的细小病毒抗血清能 与N S l 产生交叉免疫反应，而结构多肽仅在紧密相关的几种细小病毒之间产生这种类似反应“”，脊椎动 物细小病毒N S l 基因的遗传是极为保守的。因此我们考虑了通过P C R 扩增该段基因并测序来进一步确 认分离的病毒为猪细小病毒。 8 1 细小病毒分离细胞及分离条件的选择 一般首次分离细小病毒时，最好先制备原代细胞进行分离，待细胞毒力稳定后就可以再将病毒接 种到S T
14、 、I B R S 2 ，P K l 5 等细胞系，让其适应细胞并增殖。但在本研究中，发现采集的个别流产胎儿 病料直接接种I B R S 一2 后能够迅速引起细胞出现脱落等细胞病变。但在随着病毒传代次数的增加，发 现接毒的量越来越大，并且出细胞病变的时间也逐渐加长。这可能与细小病毒形成病毒样空壳粒子干 扰颗粒的特性有关M j 。如果耍继续增殖病毒，还得必须重新在原代细胞中进行复壮。因此，在进行细 小病毒分离的时候，最好还是用原代细胞。 细小病毒的复制必须依靠细胞在进行分裂过程中的一些酶，因此接种细小病毒要求在细胞进行传 代的同时，或者在细胞长到l 3 的时候，最迟不晚于长满2 3 时进行接种。
15、同时，S m i t h 【9 】和J o oH S i 0 报道，牛血清中存在干扰病毒复制的因子，能抑制细小病毒的繁殖。因此接毒后最好不要添加有血清 的营养液。在本文的实验过程中，为了满足以上两点的要求，我们先将病毒进行同步接种，到细胞长 到满约1 ，3 时，换成无血清的D M E M 维持液。结果病毒能很好地在细胞中进行增殖。 32 细小病毒与圆环病毒的共同感染 P C V 2 和P P V 都为小的单链D N A 病毒，其编码蛋白的能力很弱，复制要高度依赖于宿主细胞的功能 1 1 1 ，P P V 和P C V 的复制都要依赖于S 期。最近有报道表明宿主子代细胞D N A 的合成是体外P
16、 C V 2 复制 需要的唯一的条件 1 2 】，很可能由P P V 介导的组织细胞和巨噬细胞子代D N A 合成、分裂和成熟的过程为 P C V 2 的体外复制和分离提供了最佳条件。P P V 和P C V 2 共同感染后出现大量的P C V 2D N A 及小量的 P P VD N A 也表明：接种P P V 对P C V 2 的复制具有潜在的促进作用。大量的文献都报道了猪细小病毒和猪 的圆环病毒的共同感染，这在实验室和临床上都已经得到_ 证实”1 ”l 。在本文的实验过程中，发现 采集的个别流产胎儿病料直接接种I B R S 一2 后能够迅速引起细胞出现脱落等细胞病变，同时本实验室从 同一个病料中分离出了猪圆环病毒，因此可能是由于细小病毒与圆环病毒的共同感染使是细胞的病变 加剧。因此，推测目前在四川也已有部分的猪共同感染了猪细小病毒和圆环病毒，使得病情加重。 参考文献( 略)
