《宫内移植骨髓间充质干细胞对胚胎期显性脊柱裂胎鼠神经元重建的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《宫内移植骨髓间充质干细胞对胚胎期显性脊柱裂胎鼠神经元重建的研究（42页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：星盈丑盈一一日期：型丝：圭L 旷 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中
2、国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 多盈应 指导教师签名：础 日 期：旦。垒! Z 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语8 三、论文 前言”9 刚舌” 材料与方法9 结果1 2 讨论2 1 结论2 4 四、本研究创新性的自我评价2 5 五、参考文献2 6 六、附录 综述2
3、 9 在校期间科研成绩3 8 致谢3 9 个人简介4 0 中文论著摘要 宫内移植骨髓间充质干细胞对胚胎期显性脊柱裂胎鼠 神经元重建的研究 目的 神经管缺陷( N e u r a lt u b ed e f e c t s ，N T D s ) 是常见的先天性畸形之一，世界范围内 发病率占总出生儿数的1 10 0 0 - - 一9 10 0 0 ，是世界卫生组织常规监测的疾病之一，目 前认为神经管缺陷是遗传因素和环境因素共同作用的结果，有家族遗传倾向。胚胎 发育过程中神经管发育缺陷可出现脑和脊髓畸形，其中脑裂和脊柱裂占所有类型 的9 5 ，脊柱裂根据椎管内容物是否突出脊柱皮肤分为显性脊柱裂和隐性
4、脊柱 裂。随着产前诊断技术的不断提高，越来越多的神经管畸形在孕中期或孕早期被 发现，但是产前治疗方面的研究却进展缓慢，许多母亲被迫选择终止妊娠，出生 后的神经畸形患儿的致残率和死亡率也较高。目前国内外应用胎儿外科技术进行 产前修补可以减少脑积水和脑疝的发生率，但对神经功能的恢复仍不理想，下肢 感觉运动功能障碍和尿便障碍仍然是常见的术后并发症。 干细胞移植治疗出生缺陷是目前较先进的治疗方法，宫内移植的优点包括：1 由于胎儿在宫内生长发育快，因此为植入的干细胞生长繁殖提供了有利时机；2 M S C s 经诱导分化后进行自体移植，不存在免疫反应，而且避免了社会伦理问题； 3 能够在疾病的早期得以及时
5、治疗。目前利用干细胞移植技术治疗白血病及先天 性免疫缺陷性疾病以有报道，但关于宫内干细胞移植治疗神经管畸形的报道却很 少。 先天性神经管发育畸形的治疗一直是困扰国内外学者的难题。我们前期研究 发现，先天性脊椎裂鼠支配肛门外括约肌和肛提肌的脊髓运动神经元数量明显减 少，说明脊柱裂的脊髓神经元在胚胎期已经存在明显发育异常。因此我们认为在 显性脊椎裂患儿术后神经功能恢复的治疗中，神经元的再生或修复才是最重要的 治疗原则。移植的骨髓间充质干细胞( M S C s ) 可以转化为神经细胞，这为先天性 神经系统发育异常和神经系统退行性疾病的细胞替代治疗提供了可能。因此本研 究尝试利用M S C s 进行宫
6、内移植治疗先天性脊椎裂，并对移植后干细胞的迁移和 分化情况进行评价，探索先天性脊椎裂的治疗新方法。 材料和方法 一、实验动物 1 、原代培养4 周龄W i s t a r 鼠4 0 只，体重9 0 1 0 0 9 。由中国医科大学附属盛 京医院实验动物中心提供。 2 、动物模型1 0 1 2 周龄W i s t a r 孕鼠1 0 0 只，体重2 5 0 3 0 0 9 。 二、方法 1 、原代培养及腺病毒E G F P 转染：无菌条件下取大鼠骨髓用全骨髓贴 壁培养法进行原代培养，腺病毒E G F P ( M O I 值3 0 0 5 0 0 ) 转染P 0 P 1 5 代骨髓M S C s
7、。 2 、胎鼠先天性脊椎裂动物模型的建立：孕1 0 进行4 维甲酸 ( 1 4 0 m g k g ) 胃管给药，利用药物致畸方法制作先天性脊椎裂动物模型。 3 、干细胞移植：利用胎仔外科方法将转染E G F P 的M S C s 经纤细玻璃针 注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中，并存活至2 0 天，剖宫取胎。 4 、冰冻连续切片计数移植细胞的存活数量：取2 0 天先天性脊椎裂胎 鼠的脊椎，固定脱水后做冰冻切片，计数脊髓中绿色荧光细胞数量及分布情况。 5 、免疫荧光方法检测移植细胞的分化情况：免疫荧光方法检测脊髓 冰冻切片中E G F P 阳性M S C s 中N e s t i n 、N F 、
8、G F A P 、M y o d 的表达。 结果 一、细胞浓度 流式细胞仪鉴定全骨髓细胞悬液贴壁法得到M S C s 纯度，发现细胞培养时间 越长，干细胞的纯度越高。 二、孕鼠及胎鼠存活率 被移植孕鼠共8 6 只，术后存活并得到脊柱裂标本的孕鼠共8 1 只，孕鼠存活 率9 4 。每只孕鼠平均移植2 3 只胎鼠，最后存活的胎鼠比例为7 8 。 ， 三、细胞存活情况 通过对实验结果计数分析，移植M S C s 的总存活率为2 4 。并且发现不同浓 度M S C s 、不同代数的M S C s 和不同移植时间对M S C s 存活率都有不同的影响： 在孕1 6 天、1 7 天和1 8 天时移植相同代
9、数的M S C s ，结果发现孕1 6 天存活率明显 低于孕1 7 和1 8 天，( P 0 0 5 ) ；移植M S C s 细胞 数量不同对存活率影响不大( P 0 0 5 ) 。 四、细胞分化情况 免疫荧光法检测M S C s 移植到脊髓中分化情况，发现移植M S C s 不仅分化为 不同神经细胞，包括神经干细胞( N e s t i n ) 、神经元( N e u r o f i l a m e n t ) 和神经胶质 细胞( G F A P ) 。而且可分化为肌原细胞( M y o D ) 。分化率在P I O - 1 4 代M S C s 明显 高于P 3 6 代M S C s ，
10、在1 6 天移植明显高于孕1 7 天和1 8 天( P 7 5 ) c o u l ds u r v i v e a f t e rt r a n s p l a n t a t i o n ，a n dt o t a l l y2 4 o ft r a n s p l a n t e dM S C ss u r v i v e do nf e t a ls p i n a l v e r t e b r a t er e g i o n 3 T h e r ei sat e n d e n c yo fh i g h e rs u r v i v a lr a t e 晰t l lm o r
11、 ec e l l si n j e c t e d ，i ti sn o t s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( P ) 0 , 0 5 ) T h ep a s s a g e so fi n j e c t e dM S C s ，o n l yP Oc e l l ss h o w e d l o w e rs u r v i v a lr a t e ，c e l l si nP 3 - 6o ri nP 1 0 - 1 4p r e s e n t e ds i m i l a rs u r v i v i n gr a
12、 t e i ti sn o t s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( P ) 0 , 0 5 ) T h et 1 1 i r df a c t o ri st h es t a g e so ff e t a ld e v e l o p m e n t L e s se G F P p o s i t i v eM S C ss u r v i v e do nE l6f e t a ls p i n a lv e r t e b r a t et h a no nE l 7a n dE l8 M S C sm i g r a
13、t e di n t od i f f e r e n tr e g i o no fs p i n a lv e r t e b r a t ea w a yf r o mt h ei n j e c t i o ns i t e 4 D u r i n gt h e2 - 4d a y so fd e v e l o p m e n t ，t r a n s p l a n t e dM S C sd e f f e r e n t e di n t ov a r i o u s c e l lt y p e so fs p i n a lv e r t e b r a a Se G F
14、Pp o s i t i v eM S C se x p r e s s e dt h es p e c i f i cm a r k e r so f n e u r a ls t e mc e l l ( N e s t i n ) ，n e U r o n ( n e u r o f i l a m e n t ) ，n e u r o g l i o c y t e ( G F A P ) a n dm y o b l a s t ( M y o D ) a f t e rt r a n s p l a n t a t i o n C o n c e r n i n gt h ee f f e c to fc e l lp a s s a g e so nM S C ss h o w e d h i g h e rn e u r o n a ld i f f e r e n t i a t i o nr a t ei nP 1 0 - 1 4c e l lg r o u pc o m p a r e d 谢t l li I lP 3 - 6c e l l g r o u p ( P O 01 ) D e v e l o p m e n ts t a g e sa l s oa f f e c tn e u
