《日本七鳃鳗rgd毒素肽lampetrin1的基因克隆、表达及部分生物学活性》由会员分享，可在线阅读，更多相关《日本七鳃鳗rgd毒素肽lampetrin1的基因克隆、表达及部分生物学活性（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、辽宁师范大学 硕士学位论文 日本七鳃鳗RGD毒素肽Lampetrin1的基因克隆、表达及部分生物 学活性 姓名：韩晓曦 申请学位级别：硕士 专业：动物学 指导教师：李庆伟 20070525 捅矍 R G D 毒素肽为一类含R G D 模体序列的小分子量蛋白，其可凭借蛋 白质一级结构上特有的R G D 分子序列而成为细胞外基质( E c M ) 与细 胞整合素( in t e g r i 3 ) 阃结合的强效竞争性拮抗剂。进而通过封闭 整合素的信号转导通路而起到抑制血小板聚集、抑制血管新生和抗 肿瘤细胞增殖等作用“。2 1 。 本课题组已先期完成七鳃鳗唾液腺c D N A 文库的构建。随机挑选
2、单克隆单向测序后，共得到1 2 8 1 条有效E S T 序列”1 。对其进行生物 信息学分析后，发现了三条能翻译出R G D 模体的开放阅读框，确定 了三条R G D 模体毒素肽候选基因。 L a m p e t r i n i 为源自于日本七鳃鳗口腔腺，富含半胱氨酸并具有 R G D ( A r g G 1y - A s p ) 特征性模体的基因重组蛋白，其具有R G D 毒素肽 的典型特征，且与其它家族R G D 毒素肽在一级结构上没有同源性。 从日本七鳃鳗口腔腺中提取总R N A 进行R T P C R 扩增，获得了4 2 3 b p 的月本七鳃鳗R G D 毒素肽基因。对此一毒素肽基
3、因进行克隆、转化 与诱导后，得到了该蛋白的可溶性高效表达。经组氨酸亲和层析纯 化，获得了分子量为1 6 9 k D a 的均质蛋白，并将其命名为L a m p e t r i n l 。 活性测定结果显示，L a m p e t r i n l 能呈剂量依赖性方式抑制鸡胚绒毛 尿囊膜的血管新生及A D P 诱导的兔血小板的聚集作用，具有R G D 毒 素肽的典型活性。 L a m p e tr i n l 对7 7 2 1 肝癌细胞增殖有明显的抑制作用，1 1 ) 5 0 为 2 6 4 p m 0 1 L 。这可能是由于L a m p e t r i n l 通过结合细胞表面的整合素， 而阻
4、断下游的信号转导通路而引起细胞发生凋亡。在对L a m p e t r i n l 作用的7 7 2 1 肝癌细胞进行H o e c h s t 染色也证明了这一推测。 1 3 7 肛m o l L 的L a m p e t r in 1 可引起细胞的凋亡，对凋亡细胞处理后， 提纯D N A ，进行琼脂糖凝胶电泳和E B 染色后，在凋亡细胞群中可观 察到典型的D N A l a d d e r 。 恶性肿瘤的个重要的生物学特征是对其邻近正常组织的侵润 及远处转移。模仿肿瘤细胞入侵E C M 的三个步骤，设计的体外试验 结果表明，L a m p e t r jn l 可抑制7 7 2 1 肝癌细
5、胞对人j ：基质膜m - a t r i g e l 的黏附、抑制其向b F G F 的迁移和透过m a t r i g e l 的侵润。这表明i L a m p e t r ir 1 1 具有抑制7 7 2 1 肝癌细胞侵入F C M ，进而抑制其转移的作 用。重组L a m p ec r i l l l 具有R G D 毒素肽的典型功能，有望发展成为一 种抗肿瘤新药，具有潜在的临床应用价值。 同时制备了基因重组蛋白L a m p e t r i n l 的多克隆抗体，为 L a m p e t r i n l 功能基因与蛋白的筛选与确认打下了良好的基础。 本课题的完成，将是首次在日本七鳃鳗
6、这一物种中发现并确认 R G D 毒素肽功能新基因，为R G D 毒素肽家族增添源于不同物种的新成 员，为闩本七鳃鳗的功能基因组学与蛋白质组学研究奠定理论基础， 为利用其进行抗血栓、抗肿瘤基因工程药物开发提供详尽的科学依 据。 关键词L a m p e t r i n l ，R G D 毒素肽，整合素，血管新生，血小板聚集 2 A b s tr a c t R G Dp e p t i d e sa r es m a l lm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i n sw h i c hc o n t a i n R G Ds e q u e n c e
7、 A sac o m p e t i t i v ea n t a g o n i s t ，i tc a ni n t e r f e r e t h e c o m b i n a t i o nb e t w e e nt h ee x t r a c e l l u l a r m a t r i xa n dc e l l si n t e g r a t i o nb y t h e i rs p e c i f i cR G Ds e q u e n c e D l M o r e o v e r ，R G Dp e p t i d e sa l s oc a ni n h i
8、b i t p l a t e l e ta g g r e g a t i o n ，a n g i o g e n e s i s a n dt u m o rc e l l p r o l i f e r a t i o n1 1 。2 】b y c l o s i n gi n t e g r i ns i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y Ae D N Al i b r a r yw a sc o n s t r u c t e df r o mt h eo r a l g l a n do fL a m p e t r a j
9、a p o n i c a 1 2 8 1v i r t u a lE S T s l 3 1w e r ef o u n d e da f t e rr a n d o ms e l e c t i o no f c l o n e sf o rs e q u e n c i n g ，B i o i n f o r m a t i c a l a n a l y s i s s h o w e dt h r e eR G D p e p t i d eg e n e sa n dt h r e eo p e nr e a d i n gf r a m e sw h i c hc a nt
10、r a n s l a t eR G D m o t i f L a m p e t r i n li sar e c o m b i n a n tp r o t e i no fR G D p e p t i d ef r o mL a m p e t r a j a p o n i c a I nt h i ss t u d y ，t o t a lR N A w a se x t r a c t e df r o ms a l i v a r yg l a n da n d w a sr e v e r s e l yt r a n s c r i b e dt oc D N A B
11、ya m p l i f y i n g o fc D N A ，w eo b t a i n e d L a m p e t r i n l Sg e n ew i t h4 2 3 b p S e q u e n c i n gi n d i c a t e dt h a tL a m p e t r i n lw a s n o n h o m o l o g yw i t ho t h e rR G D p e p t i d ef r o mo t h e rs p e c i e s L a m p e t r i n l c o n t a i n sm o t i f - R
12、G D A f t e rc l o n i n g ，t r a n s f o r m i n g ，a n de x p r e s s i o no f L a m p e t r i n lg e n e ，t h eL a m p e t r i n lw a sp u r i f i e d T h es o l u b l eh o m o g e n e o u s p r o t e i nw a so b t a i n e da n dc o u l ds i g n i f i c a n t l y i n h i b i ta n g i o g e n e s
13、i so f 7 - d a y s o l dc h i c ke m b r y o sa n da g g r e g a t i o no fr a b b i tp l a t e l e ti n d u c e db y A D P T h er e s u l ts h o w st h a t l a m p t r i n l h a st y p i c a lR G D p e p t i d e s f u n c t i o n s L a m p e t r i n lc o u l di n h i b i tp r o l i f e r a t i o no
14、 fS M M C - 7 7 2 1c e l l s ，t h e I D S 0v a l u eo fL a m p e t r i n lw a s 2 6 4 z m o l L T h e r e a s o nm a y b ei s L a m p e t r i n 1c a nb i n dw i t hi n t e g r i nw h i c ho nc e l ls u r f a c et op r e v e n tt h e d o w n s t r e a m s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a
15、 y ，a c c o r d i n g l y i n d u c e a p o p t o s i s L a m p e t r i n l t r e a t e dS M M C - 7 7 2 1c e l l sw e r es t a i n e dw i t h H o e c h s t3 3 2 5 8 ，af l u o r e s c e n tD N A - b i n d i n gd y e ，t oi d e n t i f yt h ea p o p t o t i c n u c l e i T h i sr e s u l ta l s od e m
16、 o n s t r a t e dt h a tL a m p e t r i n Ia tt h ec o n c e n t r a t i o n o f1 3 7 “m o l Lc o u l di n d u c ea p p p t o s i si nS M M C 一7 7 2 1c e l l s E x t r a c t i n g D N A ，b ym e a n so fa g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sa n de t h i d i u mb r o m i d e s t a i n i n g ，w ec a ns e et y p i c a lD N A l a d d e ri na p o p t o s i sc e l ll i n e s A ni m p o r t a n tb i o l o g i c a lf e a t u r eo fm a l i
