《玉屏风多糖提取和成分分析及对实验性肝纤维化预防作用及机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《玉屏风多糖提取和成分分析及对实验性肝纤维化预防作用及机制研究（112页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、安徽医科大学 博士学位论文 玉屏风多糖提取和成分分析及对实验性肝纤维化预防作用及机 制研究 姓名：王佳佳 申请学位级别：博士 专业：药理学 指导教师：李俊 20100601 安徽医科大学博士学位论文 7 玉屏风多糖提取和成分分析及对实验性肝纤维化 预防作用及机制研究 研究生 王佳佳 导 师 李 俊 教 授 （安徽医科大学药学院，合肥， 230032） 中 文 摘 要 玉屏风散由黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao、白术(炒)Rhizoma Atractylodis Macrocephalae
2、(baked)、防风 Saposhnikovia divaricata (Turez.) Schischk.三味组成，为治疗表虚自汗的经典名 方。现代中药研究认为，由于中药独特用药体系和多以复方形式用药的特点，中 药复方真正发挥药理作用的活性物质基础，是指复方中产生某种药效活性物质的 总和，因此研究中我们从玉屏风散整体出发追踪其多糖类活性成分，而非分别研 究三味组成单药的活性多糖再加以配伍组合。在我们的前期研究中，对玉屏散总 多糖进行了分级分离，通过活性筛选证实了玉屏风多糖（YPF-P）为玉屏风散中最 具药理活性的多糖类成分，且发现YPF-P对环磷酰胺诱导的免疫力低下小鼠具有 免疫调节活性，对
3、于急性化学性及急性免疫性肝损伤均具有一定的肝脏保护作 用。在此基础上，本课题组秉持药物化学研究与药理研究密切结合的研究思路， 一方面从玉屏风散复方整体中优化提取YPF-P， 并通过多种化学及仪器检测深入 研究YPF-P的组成及结构，为阐明玉屏风散活性多糖的构效关系提供化学基础； 另一方面，通过CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，从血清学、组织学、分子生物 学等水平系统观察YPF-P对大鼠肝纤维化的防治作用及其可能的发生机制， 并考 察YPF-P及其主成分多糖YPF-P1对体外培养的HSC-T6生长及对TGF-1刺激后 HSC-T6增殖的影响，为抗肝纤维化治疗研究和临床慢性肝病的防治提供新的药 物选
4、择。研究主要内容如下： 安徽医科大学博士学位论文 8 1.玉屏风多糖（YPF-P）的制备及多糖组成结构研究 YPF-P 制备实验旨在通过正交试验设计法优选 YPF-P 的提取工艺条件，并建 立 YPF-P 的含量测定方法。实验采用 L9（34）正交试验设计法制备玉屏风散活性 多糖，通过分光光度计以苯酚硫酸法测定多糖含量，以多糖提取量为指标优选 YPF-P 最佳提取工艺。结果提示，YPF-P 提取的最佳条件为料液比 1:15，于 90 提取 3 次，每次 2h。实验中成功建立了 YPF-P 的含量测定方法，验证试验表明优 选出的提取工艺稳定、合理、可行。 YPF-P 组成结构研究旨在考察 YPF
5、-P 的组成及其主成分多糖（YFP-P1）的 化学结构特征，以期阐明复方玉屏风散的药效物质基础。实验从复方玉屏风散中 经水提醇沉、脱蛋白后得到 YPF-P，先后经 DEAE sephadex A-25 柱分离和 Sephadex G-200 柱进一步纯化，得到 3 个重均分子量均一的多糖 YPF-P1、 YPF-P2、YPF-P3，通过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定多糖分子量；通过多 糖完全酸水解，通过薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）两种方法 进行 YPF-P1 单糖组成研究，并进行高碘酸氧化、红外光谱（IR） 、1H-NMR 及 13C-NMR 谱检测以掌握 YFP-P
6、1 的基本结构特征。实验结果表明，YPF-P 的组 成多糖分子量分别为 YPF-P1（488,500Da） 、YPF-P2（232,500Da） 、YPF-P3 （1,863,000Da） ；YPF-P1 为一高度分支化的杂多糖，由葡萄糖（Glc）,半乳糖 （Gal） ，果糖（Fru）及阿拉伯糖（Ara）以摩尔比 3: 2.5: 1.75: 1 组成，此外还 含有微量的鼠李糖（Rha），半量的 Gal 以半乳糖醛酸（GalA）形式存在，主链 部分由 1, 6- -D-吡喃葡萄糖苷、1, 6-D-吡喃半乳糖以 6: 5 构成, 侧链部分由 1, 3-D-呋喃果糖苷, 甲基-呋喃阿拉伯糖苷和/或甲
7、基-鼠李糖苷构成，与葡萄糖 残基 O-6 相连。 2.玉屏风多糖（YPF-P）对实验性肝纤维化的预防作用及机制研究 实验旨在考察 YPF-P 对大鼠肝纤维化的药效作用及部分机制，并研究对 HSC-T6 细胞株增殖的影响。体内实验中，通过给予 SD 大鼠皮下注射 CCl4花生 油溶液 12 周， 每周 2 次， 成功建立肝纤维化模型； 大鼠随机分为正常组， 模型组， 安徽医科大学博士学位论文 9 YPF-P (30, 60, 120 mgkg1)三剂量组，黄芪多糖（AP）60 mgkg1组，秋水仙碱阳 性药对照组；采用 Masson 染色观察肝脏病理组织学改变，电镜观察肝细胞、HSC 形态，放免
8、法测定血清 HA、LN、CIV、PCIII 水平，血清 TGF-1 水平及肝组织 TGF-1 蛋白含量分别由 ELISA 和免疫组化法测定， 肝组织 -SMA 蛋白与 mRNA 水平经免疫组化法和 RT-PCR 法测定，TIMP-1、MMP-13、Procollagen 、Collagen mRNA 均经 RT-PCR 法测定。结果显示，YPF-P 能够显著减轻肝纤维化病变程 度，抑制 HSC 向 MFb 的转化进程，显著降低肝纤维化时升高的血清 HA、LN、 CIV、PCIII、TGF-1 水平，减少肝组织 TGF-1 蛋白及 -SMA 蛋白、基因的表达, 显著抑制 TIMP-1、Proco
9、llagen 、Collagen III mRNA 表达，促进 TIMP-1/MMP-13 比例恢复，除 YPF-P 120 mgkg1组增加 MMP-13 mRNA 表达(p0.05)外，其它 YPF-P 组对其表达无显著性差异；与 AP 相比，YPF-P 在 HA、TGF-1、TIMP-1 mRNA、TIMP-1/MMP-13 ratio、procollagen mRNA (p0.05)，PC 和 collagen mRNA 表达 (p0.01)上都具有更佳的疗效，但在血清 LN, CIV 和 MMP-13 mRNA 表达上无显著性差异。结果提示 YPF-P 能够有效预防 CCl4诱导的大
10、鼠肝纤维化 的形成， 延缓纤维化进程， 作用呈剂量依赖趋势， YPF-P 比 AP 更具有药效优势， 其机制与抑制 TGF-1 表达、恢复 TIMP-1/MMP-13 酶系的平衡，抑制基质胶原 的生成促进降解有关。 体外实验中，通过绘制细胞生长曲线观察 YPF-P、YPF-P1 对 HSC-T6 生长 的影响，采用 MTT 法考察 YPF-P、YPF-P1 对 TGF-1 诱导的 HSC-T6 增殖的影 响。结果表明，YPF-P（50、100、200mg/L） 、YPF-P1（100、200mg/L）给药均 可抑制正常 HSC-T6 的增殖；YPF-P 50-200mg/L（p0.01），YP
11、F-P1 12.5-25 mg/L （p0.05） 、 50-200 mg/L （p0.01） 均可抑制 TGF-1 诱导的 HSC-T6 增殖； YPF-P1 增殖抑制率多高于同等剂量的 YPF-P（100 mg/L 除外），24h 内 YPF-P 增殖抑制 率高于 YPF-P1。结果提示，YPF-P、YPF-P1 均具有对 TGF-1 诱导的 HSC-T6 增殖抑制作用，YPF-P 发挥作用较快，YPF-P1 在抑制强度上更具优势。 关键词：多糖；玉屏风；肝纤维化；活性成分；基质金属蛋白酶；肝星状细胞 安徽医科大学博士学位论文 10 Extraction and Component Ana
12、lysis of Fractioned Polysaccharide from Yupingfengsan (YPF-P) and Its Protection Effects on Experimental Liver Fibrosis PH.D candidate: Wang Jiajia Preceptor: Prof. Li Jun (School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei, 230032) ABSTRACT Yupingfengsan (YPF, Jade Windscreen Powder in English, Gy
13、okuheifusan in Japan), a classical traditional Chinese medicine (TCM) formula, contains three herbal medicines: root of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (baked), Saposhnikovia divaricata (Turez.) Schischk. Our previous research d
14、emonstrated a fractioned polysaccharide (YPF-P) from YPF total polysaccharide was active in immunological regulation and had protection effect on actue liver injury in mice. Nowadays, the active components from the whole TCM formula are considered more reasonable to be regards as the active origin o
15、f formula pharmacological action. Therefore, in this paper, we isolated YPF-P from the whole YPF formula, purified its component polysaccharides, and investigated the chemical features of YPF-P1, the main constituent polysaccharide of YPF-P. On the other hand, the prevention effect of YPF-P on carbo
16、n tetrachloride-induced hepatic fibrosis in rats and the inhibition effect of YPF-P and YPF-P1 on HSC-T6 proliferation induced by TGF-1 were investigated. 1. Preparation of YPF-P and investigations on composition and structure To select the optimum extraction process of YPF-P, orthogonal test was employed. 安徽医科大学博士学位论文 11 Polysaccharide was extracted by deionized water and
