天然抗氧化剂抗氧化损伤作用及机制

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1、山东大学 博士学位论文 天然抗氧化剂抗氧化损伤作用及机制 姓名：杜玉 申请学位级别：博士 专业：药物化学 指导教师：娄红祥;Donna Zhang 20090523 厶fz 车博士学位论文 天然抗氧化剂抗氧化损伤作用及机制 专业：药物化学 研究生：杜玉 导师：娄红祥教授 合作导师：P r o f D o n n aZ h a n g 中文摘要 自本世纪二十年代自由基学说创立以来，对于自由基损伤的研究就不断深 入。大量研究表明，有机体的多种疾病都与自由基对机体的氧化损伤有关，自由 基对生命与健康的影响和重要性已毋庸置疑，因此寻找有效的抗氧化剂就显得十 分重要。目前，由于合成抗氧化剂如二丁基羟基甲

2、苯( B H T ) 、丁基羟基茴香醚 ( B H A ) 等多数技术复杂，成本较高，且有较大的毒性甚至致癌作用，使人们对 合成抗氧化剂产生疑虑和排斥心理，临床应用有较大的局限性，而天然抗氧化剂 安全，低毒，符合新世纪人们对健康的需求，因此，从资源丰富的天然药物中寻 找高效、低毒、价廉的抗氧化剂已成为该领域研究的一个重要方向，其抗氧化作 用机制的研究，对进一步天然抗氧化药物的研究开发具有重要意义。 第一部分葡萄籽原花青素抗心肌细胞氧化损伤作用及机制 原花青素( P r o a n t h o c y a n i d i n s 或P r o c y a n i d i n s ，简称P C )

3、 是植物中广泛存在的 一大类多酚化合物的总称。起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类。随着分离鉴定技术 的提高和对此类物质的深入研究与深刻认识，现已成为独树一帜的一大类物质并 称之为原花青素。4 0 多年来人们对从众多不同植物中提取出的P C 进行了大量研 究，作为P c 的理想来源，葡萄籽原花青素提取物( G r a p es e e dp r o a n t h o c y a n i d i n s e x t r a c t ，G S P ) 得到了最为深入和广泛的关注。G S P 是由不同数量的儿茶素或表儿 茶素聚合而成。最简单的原花青素是儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有 三聚体、四聚体

4、等直至十聚体。按聚合度的大小，通常将- - - , 四聚体称为低聚体， 将五聚体上的称为高聚体。G S P 以B 型为主，二聚体中，因两个单体的构象或 。茹只客博士学位论文 键合位置的不同，可有多种异构体，已分离鉴定的8 种结构形式分别命名为B l - - B 8 。G S P 具有多种重要生物活性，成为近年研究的热点。 心血管疾病是世界范围内导致人类死亡的一个主要病因。它包括其自身的一 套病理现象，主要有动脉硬化，高血压，充血性心脏损伤，心肌病，冠心病，心 肌肥大，心律不齐，心室纤维颤动，心动过速，心肌梗塞等。大量动物实验以及 人体实验表明氧化压力在心脏损伤的发病机理中发挥重要作用。当自由基

5、产生和 细胞内抗氧化防御的平衡被过多的自由基打破时，将会产生氧化压力从而诱导细 胞损伤。自由基和氧化压力可以诱导细胞凋亡，主要是通过脂质过氧化反应以及 形成脂质过氧化氢物。自由基清除物和抗氧化剂对多种心血管疾病具有保护作 用。 第一节葡萄籽原花青素通过诱导细胞内的抗氧化酶保护心肌细胞凋亡 大量研究表明葡萄籽提取物( G r a p es e e de x t r a c t ，G S E ) 对多种心脏疾病有保护 作用。G S E 的心血管保护作用主要归功于其抗氧化的特性。一系列研究表明多 酚是G S E 抗氧化功能的主要成分。本研究探讨从G S E 中提取分离的两种主要的 多酚化合物( 儿茶

6、素和原花青素B 4 ) 能否增加心肌细胞内的抗氧化酶，且这种 增强的细胞内抗氧化防御能否保护氧化心肌细胞损伤，取得了以下结果： 1 儿茶素或原花青素B 4 可以显著诱导心肌细胞H 9 C 2 内的抗氧化酶，该 作用成浓度依赖的趋势。 2 儿茶素或原花青素B 4 预处理可以显著降低黄嘌呤氧化酶黄嘌呤诱导的 H 9 C 2 细胞内R O S 积聚和细胞凋亡。 以上研究结果表明葡萄籽原花青素可以通过诱导细胞内的抗氧化酶保护心 肌细胞凋亡。这个可能是G S E 保护多种形式心血管疾病的一个重要机制。 第二节葡萄籽原花青素对阿霉素诱导的心肌细胞毒性的保护作用及机制 阿霉素是一种高效的抗癌药，但其严重的心

7、肌损伤的副作用限制了其临床应 用。据报道表明G S E 对阿霉素诱导的心肌细胞毒性有保护作用。本研究探讨从 G S E 中提取分离的两种主要的多酚化合物( 儿茶素和原花青素B 4 ) 对阿霉素诱 导的心肌细胞损伤的保护作用以及其相关机制，取得了以下结果： 1 儿茶素和原花青素B 4 可以减少阿霉素诱导的心肌细胞内R O S 的积聚。 2 儿茶素和原花青素B 4 可以减少阿霉素诱导的心肌细胞凋亡并防止D N A 2 厶f 夕：季博士学位论文 断裂。 3 儿茶素和原花青素B 4 可以调节心肌细胞内促凋亡蛋白B a x Q 和抗凋亡蛋 白B c l 2 的表达。 4 儿茶素和原花青素B 4 可以抑制

8、心肌细胞内的凋亡信号通路。 由于葡萄籽原花青素是G S E 的主要活性成分，以上研究结果可能是G S E 对 阿霉素诱导的心脏毒性保护作用的重要机制，因此，为临床应用G S E 和葡萄籽 原花青素治疗由阿霉素引起的心脏毒性副作用提供了理论依据。 第二部分冬凌草甲素对砷诱导的细胞毒性和细胞凋亡的保护作用及机制 砷( A r s e n i c ，A s ) 是环境中一种主要的污染物，它存在与泥土和矿石中最终进 入地下水系统，从而污染饮用水资源，含砷的地下水对人类的健康是一个巨大的 威胁。在不同的地区地下水砷污染的浓度有很大的差别，在东亚地区砷污染的浓 度最高，其中包括孟加拉国，印度和中国。国际健

9、康组织和地方政府为降低由饮 用水砷污染引起的损失做了很多努力，然而，大量人群还是暴露在砷污染的危险 中，承受着砷污染可能带来的副作用，例如高血压，动脉硬化，糖尿以及多种癌 症。最好的方法当然是降低砷的摄入，然而这并不是很现实，因为很多人无法选 择只有依靠含有砷污染的饮用水和粮食生活，因为那是他们唯一的食物来源。所 以另一种重要的解决方法就是通过调节机体的防御机制来抵抗砷的有害作用。 转录因子N r f 2 是细胞内抗氧化应答和外来物质代谢的一个关键调控子，它通过 上调A R E 相关的基因，包括那些编码细胞内抗氧化剂，二相酶和转录子的基因 来决定细胞的命运。N r f 2 依赖的蛋白表达对维持

10、细胞内氧化还原动态平衡起到 关键作用，因此，天然化合物或合成化合物通过激活N r l 2 途径可以保护细胞有 毒性物质或致癌物引起的损伤，用天然化合物或合成化合物来激活N r f 2 依赖的 适应性应答从而抵抗环境中的毒性是癌症预防的一个重要策略。近期研究表明， 激活N r f 2 信号通路对砷诱导的细胞毒性有保护作用，应用天然N r f 2 激活剂对抗 砷的毒性具有重要意义。 冬凌草甲素( O r i d o n i n ) 是从唇形科香茶菜属植物中分离出的一种贝壳杉烯二 萜类天然化合物，主要植物来源有：香茶菜、显脉叶香茶菜、毛叶香茶菜、道孚香 茶菜、冬凌草、延命草等。目前关于冬凌草甲素的研

11、究主要集中在其抗肿瘤的 3 。茹只鬈博士学位论丈 作用，其抗癌活性被认为主要是依赖其抑制肿瘤细胞增长，减少血管生成以及增 加肿瘤细胞凋亡。本研究探讨了冬凌草甲素对砷诱导的细胞毒性和凋亡的保护作 用，我们证明了冬凌草甲素是个新的N r f 2 激活剂并阐明了N r f 2 途径被激活的机 制。进一步，我们证明了用针对N r f 2 的天然化合物作为一种治疗手段的可行性， 从而保护人类免于日常生活中的各种环境因素的伤害。 第一节冬凌草甲素保护由砷诱导的U R O t s a 细胞毒性和细胞凋亡 为了明确冬凌草甲素对砷诱导的细胞毒性的保护作用，我们采用了U R O t s a 细胞( 膀胱尿路上皮细

12、胞) 模型，该模型为研究砷毒性的经典模型。取得了以下 结果： 1 1 4p M 冬凌草甲素可以显著提高细胞内谷胱甘肽水平。 2 3 0p M 亚砷酸钠 A s ( I I I ) 作用2 4 h 可以显著提高细胞内的R O S 水平，用 一系列不同浓度的冬凌草甲素可以显著地降低R O S 水平，5 6p M 冬凌草甲素的 作用最为明显。 3 用A n n e x i nV - F I T C 流式细胞检测法和H o e c h s t 染色法均表明1 4p M 冬 凌草甲素可以降低由砷诱导的细胞凋亡。 4 冬凌草甲素可以诱导U R O t s a 细胞中的N r f 2 蛋白，在浓度为1 4p

13、 M 到1 4 p M 间呈现剂量依赖关系，当剂量高于1 4p M ，会对细胞产生毒性，对N r f 2 的诱 导降低。 5 用M T T 法和克隆形成检测法均表明1 4p M 冬凌草甲素预处理U R O t s a 2 4 h 可以显著提高用砷处理4 8 h 的细胞的存活率，用N r f 2 s i R N A 转染U R O t s a 细胞后，M T T 结果表明冬凌草甲素失去了其对砷诱导的细胞毒性的保护作用。 以上研究结果表明低剂量的冬凌草甲素可以通过提高细胞内的氧化还原能 力，抑制由砷诱导的氧化压力，提高细胞的存活率以及降低细胞凋亡从而抵抗砷 诱导的细胞损伤，且冬凌草甲素的保护作用需

14、要通过激活N r f 2 途径。 第二节冬凌草甲素是一个N r f 2 转录因子激活剂 研究表明A R E 荧光素酶报告基因的活性与N r f 2 的蛋白表达水平联系紧密， 因此检测冬凌草甲素对A R E 荧光素酶报告基因的活性的影响，可以反应其对 忆的作用。 1 用高通量荧光素酶报告系统检测，结果显示冬凌草甲素剂量依赖性的提 4 - - f 力客博士学位论文 高荧光素酶的活性。 2 为了进一步确证高通量荧光素酶报告系统的检测结果，采用双荧光素酶 报告系统检测，结果也显示冬凌草甲素剂量依赖性的提高萤火虫荧光素酶的活 性。 以上研究结果证明冬凌草甲素是一个N r f 2 转录因子激活剂。 第三节

15、冬凌草甲素通过上调N r t 2 蛋白水平激活A R E 依赖的抗氧化应答 本章围绕冬凌草甲素对N r f 2 蛋白水平和对相关基因m R N A 水平的作用取得 了以下结果： 1 将双荧光素酶实验的细胞裂解液用于N r f 2 ，K e a p la n d1 3 - a c t i n 的免疫印迹 检测，结果表明，冬凌草甲素素可以剂量依赖性的提高N r f 2 的蛋白水平，1 4l x M 时作用最强。 2 检测高浓度冬凌草甲素作用是对N r f 2 蛋白水平的影响，结果表明当冬凌 草甲素浓度高于2 8g M 时剂量依赖性地降低N r f 2 蛋白水平，且K e a p l 和1 3 -

16、a c t i n 的表达没有明显变化。 3 用r e a lt i m eR T - P C R 检测了冬凌草甲素处理后N r f 2 以及其下游基因 N Q 0 1 和H O - 1m R N A 的表达水平。结果表明朋弦m R N A 水平有较弱的提高， 呈剂量依赖关系。N Q O I 和H O 1 的m R N A 水平都有显著的提高，且呈剂量关 系。 以上研究结果表明冬凌草甲素主要通过上调N r f 2 的蛋白水平来诱导N r f 2 信 号通路。 第四节冬凌草甲素阻断N r t 2 泛素化并增强K e a p l 泛素化 t B H Q 通过干扰k e a p 一1 依赖的泛素结合过程从而提高N r f 2 蛋白水平，因此， 我们也检测了冬凌草甲素调节N r f 2 泛素化的能力，取得了以下结果： 1 冬凌草甲素抑制M D A - M B 2 3 1 细胞和U R O t s a 细胞中N r f 2 的泛素化。 2 冬凌草甲素增加M D A M B 一2 3 1