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1、分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 J S 3 0 5 4 S 流行性造血器官坏死病毒E L I S A 检测方法的初步建立 P r e l i m i n a r yD e v e l o p m e n to fE L I S A f o rD e t e c t i n gE p i z o o t i c H e m a t o p o i e t i cN e c r o s i s V i r u s 研究生：刘宏 指导教师： 指导小组： 专 业：预防兽医学 获得学位名称：农学硕士 毕丁仁 段宏安 毕丁仁 段宏安 石德时 肖运才 李自力 周毅 徐烨 教授 研究员 教授 研究员
2、副教授 副教授 副教授 兽医师 兽医师 研究方向：微生物与免疫学 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学动物医学院 二。一O 年六月 - 1 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学饨论文 西l 如需保密，解密时间年月日 蜓否傈密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研兖成 菜尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过昀研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 面使用过的辫料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了
3、谢意 研究生始叫纥 峨, - - J o10 年占月7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关予保存使用学位论文的规定印学生必额按照学 校要求提交学位论文的印厣l 本和电子版本：学校有权保存提交论文的印蓐! l 版和电子版， 并提供露录检索和阕览服务，可以采用影印，缩印或扫播等复制手段保存，j c 编学位 论文本人同意华中农照大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 洼：保密学位论文( 窜涉及技术秘密、商业秘密或申i l t - # * l 等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 t 黼始叫纥獬名：抄 期
4、：伽年6 月7 日 期：缈胪多月7 日 泣：诡格本表髓接裟订农。馨协论文的绿灭和目袋之闻 流行性造血器官坏死病毒E L I S A 检测方法的初步建立 目录 摘要1 A B S T R A C T 2 缩略词表( A B B R E V I A T I O N ) 3 第一章文献综述4 1 文献综述4 1 1 流行性器官坏死病概况4 1 1 7E H N V 的防治1 0 第二章流行性造血器官坏死病毒的培养和验证1 2 1 研究目的意义1 2 2 材料方法1 2 2 1 实验材料1 2 2 2 实验方法1 3 3 结果与分析1 6 3 1 病毒的验证1 6 4 讨论1 7 4 1 细胞培养1
5、7 4 2 病毒增殖纯化l8 4 3 病毒验证18 5 结论18 第三章流行性造血器官坏死病毒M C P 蛋白的原核表达与鉴定2 0 1 研究目的与意义2 0 2 材料与方法：2 0 2 1 实验材料2 0 2 2 实验方法2 2 3 结果与分析2 7 3 1M C P 基因的扩增结果2 7 3 2M C P 基因的克隆与鉴定2 7 3 3p T - M C P 基因的序列测定与分析2 8 3 4 重组质粒的p E T - 3 2 a M C P 的构建和鉴定3 l 3 5 重组蛋白表达产物的S D S P A G E 分析结果3 1 3 6 重组蛋白表达产物的W e s t e r nb l
6、 o t t i n g 分析结果3 2 4 讨论3 3 4 1E H N VM C P 基因的扩增3 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 因表达及其包涵体的提取3 3 ：；：； 官坏死病毒抗血清的研制3 5 ：；! i ：；! ； 2 1 实验材料3 5 2 2 实验方法3 5 3 结果与分析3 7 3 1 抗原最佳包被浓度的确定( 与兔抗E H N V 血清反应) 3 7 3 2 测定兔血清效价3 8 3 3 抗原最佳包被浓度的确定( 与鼠抗E H N V 血清反应) 3 9 3 4 测定鼠血清效价3 9 3 5 亲和纯化兔抗E H N VI g G 4 0 4 讨论z l (
7、 ) 4 1 抗血清的制备4 0 4 2 测血清效价4 1 4 3 亲和纯化4 1 5 结论4 1 第五章流行性造血器官坏死病毒E L I S A 检测方法的初步建立4 2 l 研究目的意义4 2 2 材料与方法4 2 2 1 实验材料4 2 2 2 实验方法4 2 3 结果与分析4 4 3 1 包被抗体( A b l ) 和检测抗体( A b 2 ) 最佳工作浓度测定4 4 3 2 临界点的确定4 5 3 3 特异性交叉试验。4 5 3 4 特异性阻断试验4 5 4 讨论4 6 5 结论4 6 参考文献一4 8 致谢5 2 流行性造血器官坏死病毒E L I S A 检测方法的初步建立 摘要
8、流行性造血器官坏死病( E p i z o o t i ch e m a t o p o i e t i cn e c r o s i s ，E l - I N ) 是由E H N 病 毒引起的红鳍鲈鱼和虹鳟鱼的一种全身性病毒性疾病。随着我国水产业迅速发展， 水生动物疫病日益增多，特别是由E H N 等病毒引起的流行性疫病危害更为严重。本 研究针对我国水生动物疫病现状，以本实验室引进和保存的E H N 病毒为材料，进行 了该病毒的实验室培养、鉴定及其某些生物学特性研究，并在此基础上，克隆表达 了E H N V 的主要衣壳蛋白( M C P ) ，初步建立了基于M C P 蛋白的E H N 病毒
9、感染的 E L I S A 检测方法，取得了如下结果： 1 E H N 病毒的增殖和鉴定 利用对流行性造血器官坏死病毒( E H N V ) 敏感的大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系 ( C H S E ) 增殖病毒；测定了病毒毒力和培养液中的病毒滴度；采用蔗糖密度梯度离 心法对收获的病毒进行了纯化；通过S D S P A G E 和W e s t e r nb l o t t i n g 方法对纯化病毒 进行了病毒组份鉴定和免疫学活性分析，为后续E H N V 高免血清的制备及E L I S A 检 测方法的建立奠定了基础。 2 E H N V o M C P 基因的克隆与高效表达 参照G e n B
10、a n k 已发表的流行性造血器官坏死病毒( E 删V ) M C P 基因序列，以 本实验室保存的E H N V 毒株为实验材料，提取D N A ，将用P C R 方法扩增得到的 M C P 基因克隆到p M D l 8 T 载体上，对重组质粒进行酶切鉴定和序列测定。结果表 明，扩增片段的长度为1 3 9 2 b p ，所测得的基因序列与G e n B a n k 上所报道的E H N V 的M C P 序列同源性在9 9 以上。将重组基因插入原核表达载体p E T 3 2 a ，成功构建 了重组表达质粒E T 3 2 a ，并在大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) q b 获得了高效表达；对表达产物 进行S D S P A G E 电泳分析，结果与预期蛋白大小一致， W e s t e r n b l o t t i n g 检测表明， 该表达蛋白具有良好的免疫学活性。 3 E H N 病毒E L I S A - M C P 检测方法的初步建立 用纯化的E H N V 免疫新西兰大耳
