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1、微生物学通报 APR 20, 2008, 35(4): 572576 Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS tongbao 基金项目：国家“863 计划”课题资助项目(No. 2002AA514010, No. 2001AA514024) * 通讯作者：Tel: 010-68902330; : cnu_xsyang 收稿日期：2007-09-06; 接受日期: 2007-11-28 专论与综述 代谢木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌研究进展 张金鑫 田 沈 刘继开 张亚珍 杨秀山* (首都师范大学 生命科学学院 北京 100037) 摘
2、 要: 随着能源价格的持续上涨, 使用木质纤维素生产燃料乙醇已具有重要的实践意义。木糖 是多数木质纤维素水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖, 传统乙醇生产菌株酿酒酵母不能利 用木糖, 这为使用以木质纤维素为原料发酵生产乙醇带来了困难。多年以来人们试图通过基因 工程和细胞融合等方法对其进行改造使其能够代谢木糖生产乙醇。本文主要介绍这方面的研究 进展。 关键词: 酿酒酵母, 木糖, 乙醇, 基因工程, 细胞融合 Progress of Engineered Saccharomyces cerevisiae of Xylose Metabolism and Fermentation for Eth
3、anol Production ZHANG Jin-Xin TIAN Shen LIU Ji-Kai ZHANG Ya-Zhen YANG Xiu-Shan* (College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037) Abstract: With the constant rise of energy price, it has a great practical meaning of using lignocellulose to produce ethanol. Xylose is a kind of mono
4、saccharide whose content is only less than glucose in most ligno- cellulosic hydrolysates. There is some difficulty of producing ethanol from lignocellulose by the traditional ethanol production strain Saccharomyces cerevisiae, because it cannot metabolize xylose. People have tried to use genetic en
5、gineering technology and cell fusion method to modify Saccharomyces cerevisiae to make it metabolize xylose and produce ethanol for many years. This review indroduced the progress in this field. Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Xylose, Ethanol, Genetic engineering, Cell fusion 石油价格的持续上涨和温室效应引起的全球
6、变 暖, 使得人们越来越重视可再生能源的开发和利 用。生物质能便是一种重要的可再生能源, 以生物 质为原料生产燃料乙醇具有广阔的发展空间。长期 以来, 人们利用淀粉和糖类发酵生产乙醇。这些原 料成本较高, 大大限制了生物质燃料乙醇产业的发 展。在全球每年光合作用生产的高达 1500 亿吨 2000 亿吨的生物质中 80以上为木质纤维素类物 质, 它十分廉价且容易获得, 因此以木质纤维素为 原料生产燃料乙醇, 具有重要的实践意义。 木质纤维素是纤维素、半纤维素和木质素等的 聚合物。利用酸解或酶解的方法可将木质纤维素转 化为大量的五碳糖(木糖和阿拉伯糖) 和六碳糖(葡 萄糖、半乳糖和甘露糖)。木糖
7、在大多数木质纤维素 水解物中是含量仅次于葡萄糖的一种单糖, 可达 30。分析表明, 充分利用木质纤维素原料中的木 张金鑫等: 代谢木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌研究进展 573 糖发酵生产乙醇能使乙醇产量在原有基础上提高 251。 所以, 如何通过对已有菌株进行改造使其能 高效利用木糖产乙醇已成为使木质纤维素资源得以 充分利用的关键问题之一。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为工业 上生产乙醇的优良菌株, 多年以来人们试图通过基 因工程和细胞融合等方法对其进行改造使之能够代 谢木糖生产乙醇。 本文主要介绍这方面的研究进展。 1 木糖的代谢木糖的代谢 木糖进入微生物细胞
8、后首先要转化为其异构体 木酮糖以便进入戊糖磷酸途径(PPP)。自然界中木糖 转化为木酮糖的途径有两条。在某些细菌中, 通过 木糖异构酶(Xylose isomerase, XI)直接将木糖转化 为木酮糖。在可利用木糖的酵母菌中, 木糖首先在 木糖还原酶(Xylose reductase, XR)作用下被还原为 木糖醇(Xylitol), 再在木糖醇脱氢酶(Xylitol dehy- drogenase, XDH )作用下生成木酮糖(Xylulose)。 木酮 糖再经木酮糖激酶(Xylulose kinase, XK)作用生成 5- 磷酸木酮糖(Xylulose-5-phosphate), 由此
9、进入戊糖 磷酸途径(PPP)。PPP 途径的中间产物 6-磷酸葡萄糖 和 3-磷酸甘油醛通过糖酵解途径生成丙酮酸, 丙酮 酸在缺氧条件下被丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶脱羧 还原为乙醇 (图 1) 。 图 1 细菌和酵母的木糖代谢途径 Fig. 1 Xylose metabolic pathway in bacterium and yeasts 2 应用基因工程技术构建重组酿酒酵母 发酵木糖生产乙醇 应用基因工程技术构建重组酿酒酵母 发酵木糖生产乙醇 2.1 引入木糖向木酮糖转化途径 酿酒酵母不能发酵木糖, 但能发酵其异构体木 酮糖, 因此构建利用木糖产乙醇的重组酿酒酵母有 两个策略：一是在酿酒酵母
10、中克隆并表达天然利用 木糖酵母菌的两个基因, 即木糖还原酶基因 XYL1 和木糖醇脱氢酶基因 XYL2; 二是在酿酒酵母中克隆 并表达木糖异构酶基因 XYLA。 在酿酒酵母中同时表达木糖还原酶基因(XYL1) 和木糖醇脱氢酶基因(XYL2)可使酿酒酵母获得利用 木糖的能力。但是, Ktter 等2进行了深入研究, 在 厌氧条件下使用表达树干毕赤酵母(Pichia stipi- tis)XYL1, XYL2 的酿酒酵母转化子 pRD1 进行批式发 酵实验, 当木糖浓度为 21.7 g/L 时, 乙醇产量只有 0.07 g/g, 乙醇体积产率仅为 0.07 g/(Lh), 而木糖 醇产量为 0.4
11、6 g/g, 木糖被转化成了大约等摩尔的 木糖醇和乙醇（表 1）。这主要是因两种氧化还原 酶所需的辅因子不平衡而引起的。P. stipitis 的木糖 还原酶可分别以 NADH 和 NADPH 为辅酶, 但对 NADPH 的亲和力大。 而木糖醇脱氢酶(XDH)只有利 用 NAD+才能使木糖醇氧化为木酮糖。在厌氧条件 下, 因 NAD+不能再生而导致胞内氧化还原不平衡 而使木糖醇积累并向胞外分泌。人们曾试图通过改 变菌种的遗传背景而使木糖代谢过程中细胞内氧化 还原状态维持平衡, 如在敲除 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 基因(ZWF1)或 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(GDN1) 的酿酒酵母中同时超表达外源
12、 XYL1、XYL2 及自身 的木酮糖激酶基因(XKS1), 分别构建了重组酿酒酵 母 TMB3255 和 TMB3008, 其乙醇产率均显著提高。 在敲除 ZWF1 基因构建的工程菌 TMB3255 中, 最高 乙醇产量达 0.41 g/g, 木糖醇产量最低为 0.05 g/g, 但 这 些 突 变 同 时 降 低 了 木 糖 的 吸 收 速 率 3 。 Watanabe 等4通过对 P. stipitis 的 XDH 进行定点诱 变, 得到了一个对 NADP+亲和力提高 4500 倍且催 574 微生物学通报 2008, Vol.35, No.4 化效率与野生型 XDH 相当的酶。 最近证
13、明, 当此酶 与 P. stipitis 野生型 XR 共表达于 S. cerevisiae, 混糖 发酵时, 与同时表达 P. stipitis 野生型 XR和 XDH的 重组菌相比, 木糖醇的分泌减少了 86, 乙醇产量 增加了 41, 达 0.46 g/g5。有研究发现, XYL1 与 XYL2 相对表达水平的变化也影响最终代谢产物的 形成6。Eliasson7等指出, 建立在动力学模型基础 上的模拟数据显示三种酶活 XR/XDH/XK 比值为 1:10: 4 时, 木糖醇的积累最少。基于这一理论, 我研究组正将 XYL2和 XKS1分别置于不同强度的启 动子控制下并通过诱导型启动子人为
14、控制 XYL1 的 表达量, 试图通过优化三种酶的酶活水平减少木糖 醇的积累增加乙醇产量8。 在酿酒酵母中引入木糖异构酶基因(XYLA)是使 其获得代谢木糖能力的又一途径。该基因曾先后从 大肠杆菌等多种细菌中克隆得到, 并分别连接于酵 母组成型启动子下, 转化于酿酒酵母中。但各种来 源的 XYLA 基因在酿酒酵母中均没有得到活性表达。 直到 Walfridsson9等克隆高温细菌 Thermus ther- mophilus 的木糖异构酶基因并首次在酿酒酵母中得 到活性表达。 但该重组菌株表达的 XI 的最适温度为 85, 在乙醇发酵的常规温度(30) 时, 其活性仅 为最适条件下酶活的 4。
15、在此基础上 Lonn 等10 用易错 PCR 方法对 T. thermophilus 的 XYLA 进行定 向改造, 试图解决 XI 最适温度过高的问题, 但效果 仍不理想。Kuyper 等11将一种厌氧真菌 Piromyces sp. E2 的木糖异构酶基因 XYLA 首次在酿酒酵母中 高水平活性表达, 但此重组菌以木糖为单一碳源生 长缓慢。经过对表达 XYLA 的酿酒酵母进行进化工 程改造, 获得了能在木糖上厌氧生长并产乙醇的菌 株 RWB-202-AFX12。 为了进一步提高乙醇产率, 除 了表达 XYLA 基因, Kuyper 等13又将从木糖转化到 糖酵解中间产物所需的全部基因均过量
16、表达, 同时 将酿酒酵母的醛糖还原酶基因 GRE3 敲除以减少木 糖醇产生而得到重组菌 RWB217, 其利用木糖产乙 醇 能 力 可 达0.43 g/g, 乙 醇 产 生 速 度 达 到 0.46 g/(gh)（表 1）。由于通过木糖异构酶将木糖 转变为木酮糖仅需要一步反应且不需任何辅酶, 所 以这一路径的开拓是十分有意义的。 2.2 下游代谢途径的改造 木酮糖激酶(xylulokinase, XK)催化木酮糖转化 为 5-磷酸木酮糖, 处于木糖代谢物进入 PPP 的节点, 是提高木糖代谢向下游进行的关键酶。酿酒酵母本 身具有该酶, 但表达量不大。研究表明在表达 P. stipitis 的 XYL1、XYL2 的同时超表达自身木酮糖激 酶基因(XKS1)的重组酿酒酵母, 木糖利用水平和乙 醇得率都有所提高14。Johan
