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1、实验二细菌涂（抹）片的制备和革兰氏染色 目的要求：1、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。 2、认识革兰氏染色和抗酸性染色的反应特性。 实验内容： 1、 细菌抹片的制备： l玻片准备：透明、洁净、无油渍。 l抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。 l干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。 2、 细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。 3、 细菌常用染色方法：革兰氏染色法 细菌抹片 的制备 革兰氏染色法： 1. 制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥 、固定。 2. 初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。 3. 媒染：用碘液冲
2、去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。 4. 脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾 斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出 的乙醇无紫色时（2030秒），立即水洗。 5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。 6. 镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。 革兰氏染色法原理：革兰氏染色法原理： 革兰氏染色法将细菌分为革兰氏染色法将细菌分为GG和和G- G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组成，这由两类细菌细胞壁的结构和组成 的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染 剂能与结晶紫结合形成结
3、晶紫剂能与结晶紫结合形成结晶紫- -碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。 用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。GG细菌的细胞壁主细菌的细胞壁主 要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使 细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫碘的复合物碘的复合物 不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染
4、仍然保持初染剂的蓝紫色。 G-G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处 理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫碘的复合物比碘的复合物比 较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。 G+菌与G-菌细胞壁的区别 细胞壁 革兰阳性菌 革兰阴性菌 强 度 较坚韧 较疏松 厚 度 2180nm 1015nm 肽聚糖层 可达50 层 12层 肽聚糖量 50%80% 5 %80% 糖类量
5、 约45% 15%20% 脂类量 1%4% 1122% 磷壁酸 外 膜 革兰氏染色法过程示意图 革兰氏染 色法动画 革兰阳性菌 革兰阴性菌 革兰氏 染 色法革兰氏染 色法动画 实验报告： 1、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察结果。 2、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。 涂片干燥固定 染色12min 水洗、吸干 镜检 细菌的单染色 细菌抗酸染色 1. 初染:用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰 高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发 减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用 水冲洗。 2. 脱色: 3%盐酸酒精脱色30秒1分钟；用水冲洗。 3.复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用 油镜观察。
