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1、 第四章 胚胎培养及离体授粉 目的与要求 了解植物胚培养类型、过程、培养条件,以及胚培 养的应用。了解植物胚乳培养过程和培养条件,了解 胚乳培养在实践中的应用。认识植物胚珠和子房培养 方法及其在生产上应用。 具备胚胎培养基本认知,有进行各类胚胎培养的基 本能力。 一、胚胎培养概念 胚胎培养是将植物的胚胎与母体分离,培养 在已知化学成分的培养基上。 二、胚胎培养应用: 1、解决育种中实践中遇到的问题; 2、研究胚胎发育过程中与胚发育有关的内外 因素。 三、胚胎培养类型 幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培 养、子房培养 第一节 胚培养 一、培养类型 所谓胚培养就是采用人工方法把胚从种子、 子房
2、、胚珠中分离出来,放在无菌条件下让其进 一步生长发育、以至形成幼苗的过程。 1、离体胚培养时期 自养期:能在基本的无机盐和蔗糖培养基上生长 。 异养期:幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。 2、离体胚培养类型 成熟胚培养(子叶形成以后) 幼胚培养(子叶形成之前) 二、培养过程 1、幼胚培养过程 Hanning早在1904年就培养了萝卜和辣根菜的胚,发 现离体胚可以充分发育,并且提前萌发形成小苗, 这是世界上胚培养最早获得成功的一例。 幼胚培养的关键技术:取材时期 幼胚剥离 培养条件的控制 (是否需要特殊处理) 成熟或未成熟子房70%酒精浸数S0.1%升 汞或饱和漂白粉浸10-30min无菌水冲洗剖
3、 出胚珠取出完整胚接种在培养基上。 一般采用固体培养法。(同时配制两种培养基 ) 培养条件: 20-30,2000Lx。10-14h 幼胚离体培养的生长发育方式; (1)胚性发育 胚只是在体积上增大甚至超过正常胚大小而不 能萌发成苗。 (2)早熟萌发 幼胚不再发育,迅速萌发成幼苗。多数情况一 个幼胚萌发成一个植株,有时因细胞分裂形成许多 胚状体,进而形成许多植株,即丛生胚现象。 (3)愈伤组织 多数植物幼胚形成愈伤组织。再分化成胚状体 或形成芽苗。 2、成熟胚培养过程 种子95%酒精消毒选取完好种 子70%酒精浸数S0.1%升汞或10% 次氯酸钠浸泡无菌水冲洗种子培 养几天剥离种胚接种在培养基
4、上 。 培养条件: 黑暗培养、25 三、影响因素 (一)培养基 1、无机盐 成熟胚是含有根原基和茎原基以及一个或两个次 生附属子叶。培养时进一步发育产生根和茎,此时在 营养上相对独立,只需要提供简单的营养条件,在含 有大量元素的无机盐和糖的培养基上即能生长。 幼胚则是异样的,要求更复杂的培养基。除了一 般的无机盐成分外,还要加入微量元素和生长辅助物 质,不同发育时期的幼胚对培养基成份要求不同,胚 龄越小培养及成份越复杂。 2、糖类 幼胚需要蔗糖浓度较高 作用:调节培养基渗透压,作为碳源和能源, 防止幼胚早熟萌发。 成熟胚2%,幼胚8-12%。培 养过程中,转移到蔗糖水平低的培养基上。 3、氨基
5、酸和维生素 加入氨基酸,能刺激胚 的生长。加单一氨基酸时,以谷氨酰胺最好。 维生素对幼胚是必须的,对已萌发的胚,可能 有抑制作用。 4、植物生长调节物质 成熟胚一般不需要外源激素就可萌发,但加入 激素可显著增加培养物的生长,尤其对打破休眠 。 幼胚培养的关键是使加入的生长调节剂和植物 内源激素间保持某中平衡,以维持其胚性生长。 5、天然有机物 加入一些天然的胚乳或种子提取物,对离体胚 生长有促进作用。 (二)培养条件 1、PH 5.2-6.0,水稻5.0,柑橘5.8 2、温度 25 -30 左右 3、光照 黑暗或弱光 4、培养基形态 液体适合幼胚培养,固体适 合成熟胚培养 (三)胚柄 胚柄是一
6、个短命的结构,长在原胚的胚根一端, 当胚达到球形期,胚柄发育到最大。 胚柄可参与幼胚的发育过程。一般胚柄较小,很 难与胚一起剥离出来,所以培养的胚都不具备完整 的胚柄。 在幼胚培养中,胚柄的存在对幼胚的存活是关键 。因为胚柄的存在会显著刺激胚的进一步发育,在 胚发育的心形期达到高潮。 没有胚柄存在时,一定浓度范围的KT可促进幼胚 生长,但赤霉素作用更好。 四、胚培养的应用 1、远缘杂交中应用 2、克服珠心胚的干扰,提高育种效率 3、缩短育种周期 4、测定休眠种子的萌发率 5、理论研究中应用 胚 珠 及 胚 囊 的 发 育 第二节 胚乳培养 胚乳培养将胚乳从母体上分离出来 ,在无菌条件下人工培养
7、,使其生长发育 成为幼苗的过程。 胚乳培养的最早研究始于1933年, Lampe和Mills首例进行了玉米胚乳培养。 到目前为止,已有40多种植物的胚乳进行 了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞 、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、 马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再 生植株。其它有的分化出芽、根、叶等或 得到愈伤组织。 一、培养过程 1、胚乳外植体的制备 胚乳较大块组织的种子,可直接将 种子表面灭菌,无菌条件下除去种子的外皮 即可培养。 桑寄生类植物,胚乳被流质层包裹 ,不好取出胚乳,可先将种子表面灭菌,无 菌条件下剥开种皮,去掉粘性流质层,取出 胚乳。 带果实的的种子(斛寄生类),取 授
8、粉几天后的幼果,表面灭菌后,无菌 条件下切开幼果,取出种子,小心分离 出胚乳,接种在培养基上。 培养室温度25-27,黑暗或弱光下 桑寄生科 蔷薇亚纲的一科。半寄生性灌木,稀草本 ,寄生于木本植物的枝上,少数为寄生于根 部的陆生小乔木或灌木。花以造孢细胞发育 成的胚囊所代替。主要产于世界热带地区, 温带分布较少。中国,大多数分布于华南和 西南各省区;有些种类可供药用,如桑寄生 、广寄生、槲寄生等。根据花的形态、花粉 粒和果的构造不同,分为桑寄生亚科和槲寄 生亚科。 2离体胚乳的发育及其植株的形成 愈伤组织的诱导 胚乳接种后的6-10天后,不断增生成乳白 色团状,成为愈伤组织。少数胚乳外植体可转
9、为 绿色叶状丛。 愈伤组织的再分化 生长旺盛的愈伤组织应及时进行分化培养 ,此时需光。有器官发生和胚胎发生途径。 胚乳苗的生根培养 转入生根培养基10-15天后即可长根 植物胚乳可分为两大类: 被子植物胚乳被子植物中它是双 受精的产物,胚乳属于三倍体。 裸子植物胚乳裸子植物很特殊, 它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物 的胚乳为是单倍体。 3、适合培养的胚乳的发育时期 几种植物胚乳培养的最佳时间(授粉后 天数) 大 麦 1012天 黄 瓜 716天 小黑麦 714天 4、胚乳植株染色体数目的检查 取胚乳培养植株根尖、幼叶或胚乳愈伤 组织,0.2-0.5%秋水仙素(或对二氯苯饱和 溶液)25下处理
10、4-8h,流水冲洗,卡洛氏 液或FAA固定,1mol盐酸60水溶下水解 10min,染色、压片、观察。 二、影响因素 (一)培养基 1、White 和 MS 2、辅助生长物质 2,4_D,玉米素等 3、天然提取物 20%番茄汁、葡萄汁、玉米 汁、椰乳、水解酪蛋白、酵母提取物促进胚乳培 养 4、蔗糖 3-5%。小麦8%,枸杞5% 二、影响因素 (二)培养条件 1、ph 4.5-6.3 2、光照 10-12h黑暗和光照交替 3、温度 24-26 二、影响因素 (三)胚的影响 带胚的胚乳产生愈伤组织 比不带胚的高。当愈伤组织形成后,除去胚并不 影响胚乳组织的增殖。胚对胚乳培养的影响与胚 乳的生理状态
11、或年龄有关。处在旺盛生长期的未 成熟胚,在诱导培养基上无胚存在时,可形成愈 伤组织。对成熟胚乳,特别是干种子的胚乳进行 培养时,由于其生理活动十分微弱,在诱导其脱 分化前,必须借助于原位胚的萌发使其活化。胚 对胚乳的增殖作用,有人认为是某种“胚性因子” 在起作用,这种胚性因子可能是赤霉素。 二、影响因素 (四)胚乳发生类型和发育程度 1、发生类型: 核型:精核与极核受精后,只以核的分裂方式增殖。占61% 细胞型:受精后,以细胞分裂方式增殖。 混生目型:两种方式混生增殖。 2、发育时期: 早期:愈伤组织诱导率低 旺盛生长期:最容易诱导产生愈伤组织 成熟期:诱导率很低。水稻和桑寄生科的一些木本植物
12、例外 胚乳培养中,旺盛生长期是取材的最适时期。 三、再生植株的染色体倍数 1、稳定型 继代培养后染色体无变化,植株三倍体 2、畸变型 细胞染色体异常,植株为多倍体,且不一 致,形成多种倍性细胞组成的嵌合体。 四、胚乳培养的应用 培养胚乳的首要目的是为了直接获得三倍体植株。 三倍体六倍体生产 倍性多样性筛选非整倍体植株 杂种胚乳附加系和换代系遗传育种 第三节 胚珠和子房培养 一、胚珠培养 将胚珠从母株中分离出来,放在无菌的人工环 境条件下,让其进一步生长发育,以致形成幼苗的 过程。 根据胚珠是否受精分为两类: 受精胚珠的培养 未受精胚珠的培养 (一)胚珠培养的过程 1、胚珠的获取 培养受精胚珠,
13、摘取授粉时间合适的子房 ,如培养未受精胚珠,则在授粉前摘取子房。 表面灭菌 剖开子房壁,取出胚珠或带胚珠的胎座接 种。 2、培养条件 固体培养基,White,Nitsch(普遍使用),MS 培养基。附加天然有机物和氨基酸。 蔗糖浓度:幼嫩胚珠4-10%,胚珠内含有合子和 少数胚乳核5-6%,刚受精的胚珠8% 室温26,50-60%相对湿度,光照18h, 3、受精胚珠的发育 胚珠种子 胚珠愈伤组织 二、子房培养 将子房从母株上摘下,放在无菌的人工环境 条件下,让其进一步生长发育,以至形成幼苗 的过程。 根据培养的子房是否授粉分为: 授粉子房培养 未授粉子房培养 (一)子房培养的过程 1、子房的获
14、取 未授粉子房在开花前1-5天摘取子房,授粉子 房在授粉后摘取子房。 灭菌:禾谷类幼穗表面用70%酒精擦拭即可, 双子叶花蕾漂白粉液灭菌,其他植株暴露的子房 须严格消毒,无菌滤纸吸干。 拨开幼花,子房接种到培养基上。 2、子房的培养 固体和液体培养基均可,26,50-60%相对湿 度,光照16h。 N6,MS,BN,Nitsch培养基 (二)培养子房的发育 子房性细胞愈伤组织或胚状体单倍体 植株 子房体细胞愈伤组织或胚状体二倍体 植株 三、胚珠和子房培养的应用 1、胚珠 受精胚珠培养目的打破种子的休眠 挽救胚的发育以获得杂交种 未受精胚珠培养目的获得单倍体细胞发育而来 的植株 2、子房 授粉子
15、房培养目的挽救子房内杂种胚的发育 未授粉子房培养目的获得单倍体植株 试管受精解决杂交育种中不 亲和问题。 第四节第四节 植物离体授粉植物离体授粉 在远缘杂交中,遇到两种障碍(在远缘杂交中,遇到两种障碍(受精前受精前和和受精后受精后) 离体授粉离体授粉(离体(离体/ /试管受精):将未授粉的胚珠或子试管受精):将未授粉的胚珠或子 房从母体上分离下来,进行无菌培养,并以一定的房从母体上分离下来,进行无菌培养,并以一定的 方式授以无菌花粉,使之在试管内实现受精的技术方式授以无菌花粉,使之在试管内实现受精的技术 。 三种方式三种方式: 离体柱头授粉(授于离体雌蕊的位置)离体柱头授粉(授于离体雌蕊的位置) 离体子房授粉离体子房授粉