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1、实验五 还原糖含量的测定 -砷钼酸比色法 一、糖 1. 糖的生理功能 (1)分布广泛的有机化合物,它是某些植物种子 、根、茎的重要组成部分，也是蔬菜、水果 等的重要组成部分。 (2)维持生命活动的主要能量来源。 (3)是许多植物和微生物细胞壁的重要组成部分 。 2.测定的意义 (1)在植物组织中，糖含量可高达80%左右，在 动物和人组织中，含量较少，约为干重的2% 。 (2)植物中糖的种类和含量分析，对于选种及控 制培育条件有重要的意义。 (3)在微生物发酵中控制培养基中糖等物质的含 量，对指导生产实践很重要。 (4)在医学方面根据血糖或尿糖含量的高低诊断 某些疾病。 3.测定的方法 (1)根
2、据糖溶液的折射率、比重、旋光活性等物 理性质，可用折射仪、波美比重计、旋光仪 来测定糖含量。 (2)根据糖的化学性质可用滴定法、比色法定量 测定，此外还有氧电极、酶电极等快速微量 的定糖方法。 二、实验目的 1.了解还原糖的生理意义及作用。 2.掌握砷钼酸比色法测定还原糖的基本原 理和操作方法。 三、实验原理 还原糖：指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是 还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦 芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。 利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双 糖和多糖分别提取出来。 对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其 降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样
3、品中 还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 1、砷钼酸比色原理 （1）还原糖在碱性条件下加热，可以定量地还原二 价铜离子为一价铜离子，即产生砖红色地氧化亚铜沉 淀，其本身被氧化。具体反应如下： （酒石酸钾钠） 砖红色 （2）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原 ，还原型地钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生 成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一 定范围内与还原糖地含量(即被还原的Cu2O)成 正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做 标准，就可测得样品还原糖含量。 2、测定还原糖其它方法 (1)蒽酮比色法： 强酸可使糖类脱水生成糠醛，糠醛与 蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色 ，其
4、颜色的深浅与糖含量成正比关系，在620nm 波长下可测定其光密度值。 (2) 3,5-二硝基水杨酸： 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸 及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕 红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内， 还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关 系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密 度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中 还原糖和总糖的含量。 (3)费林试剂滴定法 费林试剂由甲乙两种溶液混合而成，甲 液(硫酸铜)与乙液(氢氧化钠)生成天蓝色沉淀 ，在碱性溶液中，乙液(酒石酸钾钠)使氢氧化 铜溶解生成一种络合物，还原糖在碱性加热条 件下，可以定量还原费林试
5、剂中Cu2+为Cu1+,使 费林试剂脱色，其脱色的程度与还原糖含量成 正比关系。 四、实验材料、主要仪器和试剂 1实验材料 ：苹果 2仪器 （1）恒温水浴锅 （2）Spc22-可见分光光度计（3） 容量瓶（4）漏斗（5）研钵 3试剂 （1）铜试剂：CuSO4、酒石酸钾钠、Na2SO4、 Na2CO3、NaHCO3 （2）砷钼酸试剂：（NH4)6Mo7O244H2O、 Na2HAso47H2O （3） 200g/mL葡萄糖标准液 1、制作标准曲线: 取7支试管，按下表操作，然后以 标准葡萄糖浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标绘 制标准曲线。 管 号 葡萄糖 标标准液 mL 蒸馏馏水 mL 铜试铜
6、试 剂剂 mL 沸水 浴 砷钼钼酸 mL OD620n m 葡萄糖浓浓度 （g/ml） 0(参比)02 2 10 min 冷却 2 mL 振荡荡 2min 定 容 到 20 mL 0 1 0.11.910 2 0.21.820 3 0.31.730 4 0.41.640 5 0.51.550 60.61.4 60 提取液2ml 五、实验步骤 标准葡萄糖溶液浓度 (ug/ml) OD值 0 样品OD C0 2、还原糖的提取 称取0.5g苹果于研钵中加约30ml蒸馏水由漏 斗冲入50ml容量瓶，摇匀80水浴浸提30min冷却 加3mlZnSO4加3ml0.3N的Ba(OH)2振荡后静置 上层出现清液后再加一滴Ba(OH)2至无白色沉淀定容 至50ml。 3、还原糖含量的测定 过滤提取液取滤液0.5ml于50ml容量瓶中定 容取稀释液2ml于刻度试管中加铜试剂2ml煮沸 10min加砷钼酸试剂2ml振荡2min定容到 20ml620nm下比色测定记录结果查标准曲线。 五、结果与计算 在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数， 按下式计算出样品中还原糖百分含量。 还原糖(%)= W106 100 稀释倍数样液总体积 六、思考题 1、何谓还原糖？ 2. 简述四种常用的还原糖含量测定的原理。 （1）蒽酮比色法 （2）砷钼酸比色法 （3）费林试剂滴定法 （4） 3,5-二硝基水杨酸比色法
