蛋白质氨基酸的测定

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1、蛋白质和氨基酸的测定 1 概述 2 凯氏定氮法 3 氨基酸氮的测定 1 概述 （1）食品中的蛋白质含量及测定意 义 （2）蛋白质系数 （3）蛋白质测定方法 自学引导题 1、蛋白质系数是如何计算出来 的？ 2、蛋白质的测定方法有哪些？ 国家标准是哪一种方法？ 3、为什么说用凯氏定氮法测出 的是粗蛋白的含量？ (1) 食品中的蛋白质含量 牛肉 猪肉 兔肉 鸡肉 20 9.5 21 20 大豆 米 面粉 菠菜 苹果 40 8.5 10 2.4 0.4 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的 营养价值、合理开发利用食品资源、提高产 品质量、优化食品配方、指导经济核算及生 产过程控制均具有极重要的意义。

2、 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含 的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋 白质中还含有 微量的P、Cu、Fe、I等元素 ，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的 主要标志。 (2) 蛋白质的测定意义 不同的蛋白质其氨基酸构成比例 及方式不同，故各种不同的蛋白质 其含氮量也不同，一般蛋白质含氮 量为16%，即一 份氮素相当于 6.25份蛋白质，此数值（6.25）称 为蛋白质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有 所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡 蛋等为6.25，花生为5.46，大米为 5.95，大豆及其制品为5.71，小麦 粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。 （3）蛋白质系数 (4) 蛋白质含

3、量测定最常用的方法 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应 的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有 少量非蛋白质用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白 质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以 及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物，所以这样的测 定结果称为粗蛋白。 凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简 单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各 种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外 应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍 被作为标 准检验方法。 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定 凯氏定氮法：常量法、微量法及经改进后 的改良凯氏定氮法 (1) 原理 样品

4、与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白 质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出 ，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸 铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再 以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量 可计算出蛋白质的含量。 凯氏定氮法凯氏定氮法 1、通过学习觊氏定氮法的原理，我们可知道操作分为 哪几个大的步骤？ 2、加入硫酸钾、硫酸铜的作用是什么？ 自学引导 消化反应方程式如下： 2NH2NH 2 2 (CH)(CH) 2 2 COOHCOOH13H13H 2 2 SOSO 4 4 (NH(NH 4 4) )2 2 SOSO 4 4 6CO6CO 2 2 12SO12SO 2 2

5、 16H16H 2 2 O O 浓硫酸具有脱水性浓硫酸具有脱水性: :使有机物脱水后被炭化为碳、氢 、氮。 硫酸又具有氧化性硫酸又具有氧化性: :将有机物炭化后的碳化为二氧化 碳，硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫 ，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。 H H 2 2 SOSO 4 4 2NH2NH 3 3 (NH(NH 4 4 )2SO)2SO 4 4 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待 吸收完全后，再用

6、盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱 酸性（k5.810-10），用酸滴定不影响指示剂的变 色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方 程式如下： 蒸馏蒸馏 吸收与滴定吸收与滴定 2N2N a a OHOH (NH(NH 4 4 ) ) 2 2 SOSO 4 4 2NH2NH 3 3 NaNa 2 2 SOSO 4 4 2H2H 2 2O O 2NH2NH 3 3 + + 4H4H 3 3 BOBO 3 3 =(NH=(NH 4 4 ) ) 2 2B B4 4O O7 7 +5H+5H 2 2O O (NH (NH 4 4 ) ) 2 2B B4 4O O7 7 +2HCl+5H+2HCl+5H

7、 2 2 O=2NHO=2NH 4 4 Cl+4HCl+4H 3 3 BOBO 3 3 (4)(4)测定方法测定方法 样品消化样品消化 样品消化步骤同常量法。将消化完全的消化液 冷却后，完全转入100容量瓶中，加蒸馏水至刻 度，摇匀。 观察与思考： 1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜 色立即发生什么变化？ 2、消化过程中是否有大量的泡冲到 瓶颈，原因是什么？ 3、瓶颈有什么颜色的有毒烟产生？ 4、如何判断消化的终点？ 改进后的 消化装置 蒸馏 按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积 处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒 玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内

8、的水。 在接受瓶中加入10ml 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入 液面以下。 思考： 1、为什么在蒸 汽发生瓶中要加 入批示剂甲基橙 和硫酸？ 、加入数粒玻 璃珠的作用是什 么？ 滴定滴定：取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标 准溶液滴定至微红色为终点。 式中W蛋白质的质量分数，%； V0滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol； F蛋白质系数； m样品质量，g。 (5) 结果计算： 2.3 样品的分解条件 （1）

9、K2SO4或Na2SO4 ：提高溶液的沸点 (2)催化剂 ： CuSO4 ：Cu2SO4 2H2SO4 2CuSO4 2H2O SO2 氧化汞和汞：良好的催化剂，但剧毒； （3）氧化剂：过氧化氢 硫酸钾的作用 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的 分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度 其反应式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 一般纯硫酸的沸点在340左右，而添加硫酸钾 后，可使温度提高到400以上，原因主要在于随着 消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫 酸钾浓度增大 ，故沸点升高。 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化

10、体系温度过 高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O 硫酸铜的作用 催化剂 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不 再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝 绿色。 可以指示消化终点的到达 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。 （1） 所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加 指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈 酸性。 （2） 若样品含脂肪或糖较多时，应注

11、意 发生的大量泡沫 应加入少量辛醇或液体 石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外， 并注意适当控制热源强度。 （3） 若样品消化液不易澄清透明，可加 入300g/L23ml 过氧化氢后再加热。 2.4 2.4 注意事项注意事项 （）硫酸铜起到催化作用，加速氧化分解。 硫酸铜也是蒸馏时样品液碱化的指示剂，若 所加碱量不足，分解液呈蓝色不生成氢氧化 铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量。 （）若取样量较大，如干试样超过5g，可按 每克试样5ml的比例增加硫酸用量。 （）消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长 会引起氨的损失。一般消化至透明后继续30分钟即可 . （）蒸馏过程应注意接头处无松漏现象，蒸 馏完毕

12、，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏 1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收 瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝 不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。 （）硼酸吸收液的温度不应超过40，否则 氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。 （）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中 性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。 氨基酸态氮 的测定 双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂 、测定方法、结果计算、说明 电位滴定法：原理、试剂、 仪器、测定方法、结果计算 4.1 双指示剂甲醛滴定法 (1) 原理 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互租用而使氨 基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-N

13、H2基与甲醛结合，从 而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并 用间接的方法测定氨基酸的总量。反应式（有三种不同的推论）如 下： RC H H3N C C O R CCOH OH NH2 +HCHO RCCOOH H N CH2 +NaOH RCHCOOH NH CH2OH 或 R CH COOH N(CH2OH)2 或 RCH COONa NCH2 或 R CH NH COOH CHO (4) 操作方法 移取含氨基酸约2030mg的样品溶液2份， 分别置于250ml锥形瓶中，各加50ml 蒸馏水，其 中1份加入3滴中性红置试剂，用0.1mol/L氢氧化钠 标准溶液滴定至

14、由红变为 琥珀色为终点；另1份加 入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静 置1分钟，用0.1ml/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝 色为终点。分别纪录两次所消耗的碱液ml数。 式中 c 氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L; V1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准 溶液的体积，mL; V2用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标 准溶液的体积，mL; m测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014氮的毫摩尔质量，g/m mol (5) 结果计算 氨基酸态氮 （%） 4.2 电位滴定法 (1) 原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基 的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃 电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池， 用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的 pH值判断和控制滴定终点。 (2) 仪器 酸度计（附磁力搅拦器）； 式中：C-氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，mol/L： G-邻苯二甲酸氢钾的重量，g； V-氢氧化钠溶液用量，mL V0-空白试验氢氧化钠溶液用量，mL； 204.2邻苯二甲酸氢钾的分子量。 按下式计算NaOH标准溶液的量浓度 C= G (V-V0) 10-3204.2 (4) 试验步骤 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度 ，混匀后吸取20.0mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用 0.05mol/L氢氧