《蔗糖酶测定-2教材》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蔗糖酶测定-2教材（19页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、蔗糖酶的分离提取 及活力测定 课件编写制作、讲授及实验指导：郭慧云 120031021 一、目的要求 l1.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色定糖 l 的原理和方法； l2.学习酶蛋白分离提取的原理； l3.学习掌握细胞破壁及抽提技术； l4.学习掌握酶活力测定及其计算的方法。 220031021 l 1 1、3 3，5-5-二硝基水杨酸比色定糖的原理二硝基水杨酸比色定糖的原理 l 1）DNS试剂+ D-葡萄糖 氨基化合物 l （还原糖） （棕红色） l 2）在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强 l 度成一定比例关系。所以，可用DNS比色法测 l 定还原糖的含量。 l 3）该方法是半微量定糖
2、法，操作简便、快速、杂 l 质干扰较少。 二、二、实验原理实验原理 强碱性溶液中 沸水浴中 320031021 2、蔗糖酶活力测定的原理 l2）DNS试剂+ D-葡萄糖 氨基化合物 l （还原糖） （棕红色） l3）在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成一 l 定比例关系，所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。 l4）在一定条件下，蔗糖酶催化反应产生D-葡萄糖的量一 l 定。所以，可用DNS比色定糖法测定蔗糖酶的活力。 1）蔗糖酶催化的反应：蔗糖 D-果糖 + D-葡萄糖 沸水浴中 强碱性溶液中 420031021 3、蔗糖酶分离提取的原理 l 1）细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分
3、为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内 酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提 取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同， 破壁的方法也不同。 l 我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是： 自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利 用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内 的物质释放出来。 l 自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染 。 l 自溶法的缺点是时间较长。 l 520031021 2）抽提： l 抽提（或叫萃取）是将已破碎细胞壁的材料 置于一定的条件及溶剂中，使被提取物释放出来 的过程。 l 抽提液可用水或有机溶剂。大部分酶蛋白能 溶于水、稀盐、稀碱或稀酸中。对于普通的酶
4、多 采用缓冲液，有利于酶的稳定。而一些与脂质结 合较牢固的酶，常用有有机溶剂提取。 l 抽提时缓冲液的离子强度和pH值以及温度的 选择，应既有利于酶的提取又保证酶的稳定。 l 620031021 三、试剂和器材 l（一）试剂： l1. 3,5二硝基水杨酸试剂(DNS) 4. 5%的蔗糖溶液 l2. 1mol/L的 NaOH溶液 5. 乙酸钠 l3. 0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液 6. 乙酸乙酯 l（二）器材： l1烧杯、搅拌棒、滴管 2. 量筒、移液管、吸耳球 l3试管、血糖管（或刻度试管）4秒表、天平 l5冰盐浴、沸水浴 6恒温水浴 l7. 离心机、内外套管 8. 冰柜 l9分光
5、光度计 、比色杯、镜头纸、滤纸 l10. 高活性干酵母粉、硫酸纸、皮筋套 l11保温烘箱（恒温在35 过夜） 720031021 四、操作步骤 l1、蔗糖酶的分离提取：选材、破壁、提取、分离 自溶：10g高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少 量多次地加入20ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入 1.0g乙酸钠、15ml乙酸乙酯，搅匀，再于35 恒温水 浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象。 l 抽提：补加蒸馏水20ml，搅匀，盖好，于35 恒温过夜；24-36小时后，4000r/min 离心30min，弃 沉淀及脂层，得无细胞提取液，量体积V=（ ）ml ； 置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力。
6、 820031021 2、 工作曲线的制作 l l 取7支血糖管编号17，按下页表中的顺序和 数量加入葡萄糖标准溶液、去离子水、3，5-二硝基 水杨酸试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应 5min，取出后立即用流动的冷水冷却，加蒸馏水定 容至25ml，摇匀，用723分光光度计测定540nm处的A 值。 l 以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标 ， 在723分光光度计上读出工作曲线的K值、b值和r l值。 920031021 试号含糖量 （mg） 葡萄糖标准 液（ml） 去离子水 （ml） 3，5-二硝基水 杨酸试剂（ml ） 光吸收值 A540 1002.03.0 20.80.41
7、.63.0 31.20.61.43.0 41.60.81.23.0 52.01.01.03.0 62.41.20.83.0 72.81.40.63.0 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作 1020031021 l l 3 3、蔗糖酶的活力测定：、蔗糖酶的活力测定： l l .蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3min释 l 放1mg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。 l .操作： l 取两支试管分别加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸缓冲 液适当稀释过的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的 NaOH，摇匀，使酶失活（做对照），另一支做测定管； 把两支试管和5%的
8、蔗糖溶液都放在35水浴中预热 恒温；上述两试管中分别加入2ml 5%的蔗糖液，并准 确计算时间，3分钟后于测定管中加入 0.5ml 1mol/L的 NaOH，摇匀，终止反应。 l 1120031021 l.从反应混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入 l 3ml 3,5 二硝基水扬酸试剂和1.5ml水，摇匀。于沸 l 水浴中准确反应5min，立即用冷水冷却，加去离子水 l 水稀释至25ml，摇匀，于540nm处测光密度。 l.在723分光光度计上，可指示出光密度值所对应的葡 l 萄糖含量，按下面公式计算酶活力： l 蔗糖酶活力单位=葡萄糖毫克数9酶的稀释倍数 l 1220031021 五
9、、五、注意事项注意事项 1.工作曲线的使用：不许延长，因为比耳定律 只适用于稀溶液中的反应。 2.测定酶活力时的显色反应： l 一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管， l 且不要用大玻璃杯代替沸水浴锅； l 用秒表记时，取出后立即用流动的冷水冷 l 却，加蒸馏水定容至25ml，摇匀，测定 l 540nm处的A值。 3. 酶是有生物活性的蛋白质，在整个实验过程 l 中都要注意防止酶失活。 1320031021 1420031021 六、结果及数据处理 l1.原始数据： l 1）制作葡萄糖工作曲线的数据（列表） l 2）葡萄糖工作曲线的K值、b值和r值 l 3）无细胞抽提液的体积（ml） l 4）
10、测酶活时的稀释倍数、A540值 l2.数据处理： 1）蔗糖酶活力单位=葡萄糖毫克数9稀释倍数 l 2）蔗糖酶浓度=蔗糖酶活力单位/2ml E=葡萄糖mg数（4.5/0.5）E稀释倍数/2ml =（ ）u/ml l 2）蔗糖酶总活力=酶浓度无细胞提取液的体积V l 总活力：EV =（ ）u 1520031021 七、思考题 l1、简述蔗糖酶分离提取的原理及操作步骤。 l2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖法的原理及 l 操作注意事项。 l2、用723分光光度计制作工作曲线的要求。 l3、蔗糖酶活力测定的原理及两个反应。 l4、在酶分离提纯的整个过程中应注意的一 l 个关键问题是什么？ 1620031
11、021 附：本实验的原版 蔗糖酶的分离提纯及酶促 反应动力学实验 为必修、综合性大实验，讲授8学时、实验40学时 （讲授含：酶学实验和实用正交试验方法的上篇各4学时） 课件编写制作、讲授及实验指导：郭慧云 2002-9-417 原版简介 l1、 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS法）工作曲线的制 l 作及三种蔗糖酶样品（E1、E2 、E3）酶活力的测定； l2、 Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作及三种蔗 l 糖酶样品（E1、E2 、E3）蛋白质含量的测定； l3、蔗糖酶的分离提纯（细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、 l 透析和离子交换柱层析装柱、上样、洗柱、洗脱、收 l 集酶活力峰、保存）； l4、蔗糖酶米氏常数的测定（用双倒数法）； l5、用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响（含实验设 l 计方法及数据处理程序的相关知识）。 2002-9-418 Thank You! 1920031021
