《镰刀菌诱导结香对白木香叶内生真菌分布》由会员分享，可在线阅读，更多相关《镰刀菌诱导结香对白木香叶内生真菌分布（17页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、沉香形成对白木香叶内生真菌分布和群落构成的影响研究镰刀菌诱导结香对白木香叶内生真菌分布和群落构成的影响研究高晓霞1 ,周伟平1 ,王磊2 ,章卫民2 ,严寒静收稿日期基金项目 国家自然科学基金项目（81102418，31100496）；广东省中国科学院全面战略合作（2011B090300078）；广东省科技计划项目（2012A030100014）*通信作者 严寒静，女，副教授，TEL：020-39352327 Email：作者简介 高晓霞（1972-），女，博士，副教授 ，Email：*（1. 广东药学院，广东 广州 510006；2. 广东省微生物研究所，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东
2、省微生物应用新技术公共实验室，广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，广东 广州 510070）摘要 为了研究沉香形成前后白木香叶组织中内生真菌的分布和群落构成，采用石蜡永久制片法观察白木香叶组织显微结构，细胞化学法确定内生真菌的分布。通过改良的CTAB法对白木香进行总DNA提取，利用真核生物通用引物同时对植物和内生真菌rDNA ITS序列进行PCR扩增，构建内生真菌rDNA ITS文库，RFLP分析和序列测定，用PUAP软件进行系统发育分析，构建最大简约树。结果表明：镰刀菌诱导结香前后，白木香内生真菌菌丝主要分布于海绵组织和韧皮部，结香后韧皮部内生真菌菌丝相对丰度明显
3、增大；真核生物通用引物可同时扩增出植物和真菌的rDNA ITS目的片段，构建的内生真菌文库的阳性克隆率分别为84.2%和80.9%；茎点霉是未结香白木香叶内生真菌优势种群，刺盘孢菌是已结香白木香叶内生真菌优势种群；刺盘孢菌是未结香和已结香白木香唯一共同存在的有内生真菌，且丰度差异较大。不依赖分离培养的分子生物学方法可快速直观地用于植物组织内生真菌的鉴定。白木香叶内生真菌具有一定的遗传多样性，沉香形成前后白木香内生真菌群落构成差异较大。关键词 白木香；沉香形成；人工造香；内生真菌；rDNA ITS Effects of Agarwood Formation Induced by Fusarium
4、 sp. A2 on Distribution and Community Composition of Endophytic Fungi in Leaves of Aquilaria sinensisGAO Xiaoxia1 ZHOU Weiping1 WANG Lei2 ZHANG Weimin2 YAN Hanjing1*（1. Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2. State Key Laboratory of Applied Microbiology (Ministry Guangdong P
5、rovince Jointly Breeding Base), South China, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China）Abstract Using permanent paraffin-cut section, optical mic
6、roscope photography and histochemistry to observe the distribution of the endophytic fungi in leaves of Aquilaria. sinensis. Total DNA was extracted with modified CTAB method and rDNA ITS regions of plant and endophytic fungi were amplified with eukaryotic universal primers.The rDNA ITS amplicon was
7、 characterized by RFLP analysis, sequencing of rDNA ITS library and phylogenetic analyses using PAUP by maximum parsimony. Fusarium sp. A2 was used to induce the formation of resinous in A. sinensis trees. As a result, endophytic fungi mainly distributed in spongy and phloem in leaf. Endophytic fung
8、i distributed in the phloem in agarwood-producing tree and had a relatively high abundance. rDNA ITS target fragments of plants and fungi were amplified based on eukaryotic universal primers. The positive clone rate was 84.2% and 80.9% in endophytic fungi libraries, respectively. Phoma sp. and Colle
9、ctrotrichum sp. were the absolute advantage species in the leaf tissues of non-resinous and agarwood-producing tree, respectively. Collectrotrichum sp. was the only fungal species detected both in the two types of A. sinensis with different levels of abundance. The culture-independent molecular meth
10、od can be used to identify fungal species directly and rapidly from the plant tissues. Endophytic fungal communities in non-resinous and agarwood-producing A. sinensis leaf tissues were quite different.Keyword Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg, agarwood formation, artificial induce of agarwood, endoph
11、ytic Fungi, rDNA ITS白木香（Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg）是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（Aquilaria）植物，主产于我国广东、广西和海南等地。白木香木材质地松软且不含树脂而经济价值较低，但其树干在受到损伤或刺激后会分泌一种黑色而芳香的树脂，这种包含树脂的木材即为沉香。沉香是我国、印度及其他东南亚国家传统名贵中药，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘之功效1。沉香还是世界上最名贵的香料之一，可用于制造香水、焚香和工艺品等。白木香是我国生产沉香的唯一植物资源，近年来，其资源遭受严重破，现已被载入中国植物红皮书及国家重点保护野生植物名
12、录（第一批）2-3。白木香形成沉香的机理尚不明确，但大多认为沉香是沉香树植物与真菌共同作用的产物，沉香的形成与真菌代谢有关。Burkill等于1935年首次提出沉香的形成与沉香树的免疫反应有关，是菌类攻击的结果。Bhattacharya等4从受侵染的沉香树中分离到Epicoccum granulatum，提出沉香树结香与真菌感染有关5。Gibson6、Tamuli7、Tabata8、Subehan9和戚树源等10等从受感染的沉香木材中分离获得的内生真菌Philophora parasitica，Pencillium citrinum，Aspergillus tamarii，Fusarium s
13、olani，Botryodiplodia theobromae，Menanotus flavolivens及其它真菌，接种于健康组织进行人工结香试验，取得一定的成功。内生真菌是指在其生活史的某段时期生活于植物组织内部的，对宿主没有造成明显病害症状的真菌11。由于近年来研究者在药用植物中经常发现能产生与药用植物相似或相同的药用成分的内生真菌，使得药用植物内生真菌的研究备受关注12-14。目前对于药用植物内生真菌的分离鉴定通常采用传统的分离培养方法获得植物内生真菌，再利用分子生物学手段进行菌种鉴别。但是，不同培养基分离获得的真菌多样性存在差异，且许多真菌不能在现有的人工培养基上生长，这使得传统的分
14、离培养方法用于研究植物内生真菌的多样性存在局限性1515-1616。王磊等17对不同树龄的白木香及其不同组织部位进行了内生真菌的分离培养及分子鉴定，结果表明镰刀菌是结香部位的优势种群。Gong等18采用培养分离技术获得白木香内生真菌128株，其中镰刀菌为优势种群且具有良好的抗菌活性。Mohamed等19采用培养分离技术和PCR直接测序技术分析机械损伤A. malaccensis白木和暗褐色木（结香部位）内生真菌群落构成，结果表明白木和结香部位内生真菌群落构成差异不显著，但结香部位Fusarium sp.和Lasiodiplodia sp.丰度明显高于白木。Tian等20采用rDNA ITS P
15、CR克隆测序技术分析机械损伤白木香叶内生真菌的群落构成，结果表明机械损伤前后内生真菌群落构成差异较大，Colletotrichum gloeosporoides、Botryosphaeria和Cylindrocladium 可能与沉香形成有关。本研究运用石蜡切片的组织化学定位方法和不依赖于传统分离培养方法的分子生物学手段，分析了镰刀菌诱导结香前后未结香白木香和已结香白木香叶片组织内生真菌分布和群落构成差异，为快速剖析与沉香形成有关的内生真菌研究奠定基础。1 材料与试剂1.1 材料白木香叶于2010年3月10日采自广东省信宜市金垌镇，经广东药学院中药学院严寒静副教授鉴定为瑞香科植物白木香Aqui
16、laria sinensis（ (Lour.）) Gilg的叶片。其中1号样品为人工种植5年生未结香的白木香叶片，未结香的判断主要依据为白木香树干未观察到断枝、倒伏、雷击、腐木、虫蚁蛀的孔洞等现象，按照中国药典（一部）进行检查：显色反应呈黄绿色，醇溶性浸出物含量为7.250%。2号样品为“小孔滴注法”人工接种分离自白木香的内生真菌镰刀菌（Fusarium sp. A2）172121个月的白木香叶片，已结香的判断主要依据为用生长锥于人工造香接种口上行10 cm处采集样品，发现木质部已经变为黑褐色，按照中国药典（一部）进行检查：显色反应呈樱红色，醇溶性浸出物含量为9.17%（详见参考文献21）。上述方法缺少可信度，建议用化学分析的手段证实是否结香！样品采集后用蒸
