化学发光测定仪.

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1、上海丰汇生物研究有限公司 化学发光介绍 发光免疫技术 发光免疫技术(luminescence immunoassay, LIA)是将 发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新 的免疫分析技术。这种方法不仅具有发光分 析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性, 而且还具有分离简便,可以实现自动化分析特 点,使之成为医学、生物学研究领域中一种新 的重要的免疫学分析手段。 按化学反应类型按化学反应类型 化学发光的分类化学发光的分类 酶促化学发光：酶促化学发光： 辣根过氧化物酶系统辣根过氧化物酶系统 ：丰汇、强生：丰汇、强生 碱性磷酸酶系统：碱性磷酸酶系统： 贝克曼贝克曼 非酶促化学发光：非酶促化学发光：

2、 吖啶酯系统：雅吖啶酯系统：雅 培培 电化学发光：罗氏电化学发光：罗氏 闪光（闪光（FlashFlash）: : 按发光持续时间按发光持续时间 发光时间在数十分钟以上，如：发光时间在数十分钟以上，如： HRP-HRP-LuminolLuminol系统系统 AP-AMPPDAP-AMPPD系统系统 无须原位进样、无须原位进样、 以速率法测量。以速率法测量。 发光时间在数秒内，如吖啶酯发光时间在数秒内，如吖啶酯 以原位进样以原位进样(In Situ Injector) (In Situ Injector) 和时和时 间积分法测量间积分法测量 辉光（辉光（GlowGlow）: : 时间时间 发光信号

3、发光信号 辉光坪区辉光坪区 速率法测量速率法测量 原位进样原位进样 积分法测量积分法测量 闪光尖峰闪光尖峰 闪光与辉光及其测量方式的差别闪光与辉光及其测量方式的差别 发光与化学发光剂 一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射，称为发光 (luminescence)。根据形成激发态分子的激 发能可将发光分为三种类型: 1.光照发光 2.生物发光 3.化学发光。 1. 光照发光 发光剂经短波长入射光照射后进入激发态 ，当回复至基态时发出较长波长的可见光 。 电子e 光子 基态 能级 2. 生物发光 典型例子为萤火虫发光。反应底物为萤火 虫荧光素 (firefly l

4、uciferin)，在荧光素酶 (luciferase)的催化下利用ATP产能，生成 激发态的氧化萤火虫荧光素 (oxyluciferin) ，后者在回复到基态时多余的能量以光子 形式放出。 3.化学发光 化学发光是在常温下经化学反应所产生的 发射光。 化学发光是一个多步骤的过程，其机制为 某些化合物(发光剂或发光底物)可以利用 一个化学反应产生的能量使其产物分子或 反应中间态分子上升至电子激发态。当此 产物分子或中间态分子衰退至基态时，以 发射光子的形式释放能量(即发光)。 化学发光免疫技术中常用的化学 发光剂或发光底物 酶促反应的发光底物 直接化学发光剂 电化学发光剂 1酶促反应的发光底物

5、 酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而 发出光的一类发光底物，目前化学发光酶 免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（ HRP）和碱性磷酸酶（ALP），相应发光 底物为： HRP的发光底物 ：价格低廉、国内技术 成熟 ALP的发光底物 ：价格昂贵、国内无成熟 技术 (1) HRP的发光底物 常用的底物为鲁米诺或其衍生物。 鲁米诺或其衍生物 鲁米诺的氧化反应在碱 性缓冲液中进行。 （2）ALP的发光底物 常用的底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基- 4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧 乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（ 4-MUP，荧光底物）。 AMPPD AMPPD在碱

6、性条件下，被ALP酶解生成 相当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min 的分解半衰期，发出波长为470nm的持续 性光，在15min时其强度达到高峰，15 60min内光强度保持相对稳定。 2直接化学发光剂 这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变 溶液的pH等条件就能发光，如吖啶酯（ acridinium, AE）在含过氧化氢的稀碱溶 液中即能发光。 3.电化学发光剂 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。化学发光剂三联吡啶钌 Ru(bpy)32+（图19-1）和电子供体三丙胺（ TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子 而发生氧化反应。二价的Ru(bpy)32+被氧 化成三价，

7、成为强氧化剂，TPA失去电子后 被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定， 可自发地失去一个质子（H+），形成自由基 TPA.，成为一种很强的还原剂，可将一个高 能量的电子递给三价的Ru(bpy)33+使其形 成激发态的Ru(bpy)32+.。 3.电化学发光剂 激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出 一个波长为620nm的光子，回复到基态的 三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而 复始地进行，产生许多光子，使光信号增 强 。 酶促化学发光免疫分析就是利用酶对发光 底物催化作用而直接发光，通过光强度的 测定而直接进行定量。 酶促化学发光免疫分析（双抗体夹心法） 化学发光免疫技术是免疫测定技术继酶免

8、 技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光 免疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技 术（TRFIA）之后发展的一项新兴测定技 术。 化学发光免疫技术是一种高度敏感的微量 测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半 抗原）都可以用化学发光免疫技术测定。 其起步于80年代初，快速发展于90年代， 在国外化学发光免疫技术的应用处于蓬勃 发展的阶段。 化学发光免疫技术具备以下特点 ： 高度敏感，极限达10-1710-19M/L，远高于RIA 、EIA、TRFIA。 特异性强，重复性好C.V.10。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂稳定性好，无污染有效期612月。 操作简单，易于自动化。 在对环保很重视的国

9、家，CLIA成了取代RIA的 首选方法。 化学发光原理 化学发光检测主要是借助抗原和抗体在体 外特异结合后出现的各种现象，对样品中 的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检 测。 抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答 的物质。的物质。 抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结 合某种物质的球蛋白。合某种物质的球蛋白。 化学发光反应基本原理 双抗体夹心法（三明志法）原理双抗体夹心法（三明志法）原理 试剂试剂1 1 酶标记抗体酶标记抗体 待测物待测物 超顺磁珠 夹心法的剂量夹心法的剂量-反应关系曲线反应关系曲线 信号强度（信号强度（Y

10、 Y） 线性范围线性范围 待测物浓度（待测物浓度（X X） Hook(Hook(前滞前滞) )效应效应 分析灵敏度（最低检测限）（分析灵敏度（最低检测限）（95%95%可信度）：可信度）： S0S0 + + 2SD2SD在该曲线上所对应的浓度值。在该曲线上所对应的浓度值。 功能灵敏度：功能灵敏度： 测定误差（变异）测定误差（变异）20%20%的最低可检测浓度。的最低可检测浓度。 线性范围：线性范围： （分析）（分析）功能灵敏度功能灵敏度-变异变异20%20%的最高检测浓度的最高检测浓度 相关系数相关系数0.990.99的曲线范围的曲线范围 竞争法的原理竞争法的原理 待测物待测物 试剂试剂1 1

11、 酶标记抗原酶标记抗原 超顺磁珠超顺磁珠 竞争法的剂量竞争法的剂量-反应关系曲线反应关系曲线 待测物浓度（待测物浓度（ X X ） 信号强度（信号强度（ Y Y ） 线性范围线性范围 分析灵敏度（最低检测限）（分析灵敏度（最低检测限）（95%95%可信度）：可信度）： S0-2SDS0-2SD在该曲线上所对应的浓度值在该曲线上所对应的浓度值 功能灵敏度：功能灵敏度： 测定误差（变异）测定误差（变异）20%20%的最低可检测浓度的最低可检测浓度 线性范围：线性范围： （分析）（分析）功能灵敏度功能灵敏度-变异变异20%20%的最高检测浓度的最高检测浓度 相关系数相关系数0.990.99的曲线范围

12、的曲线范围 发光免疫分析基本操作步骤（一步法）发光免疫分析基本操作步骤（一步法） 待测样品待测样品 酶标记抗体或抗酶标记抗体或抗 原原 磁场中洗涤去除未结合的反磁场中洗涤去除未结合的反 应物应物 发光底物发光底物 仪器检测仪器检测 反应管反应管 反应反应1010分钟分钟 反应反应0-50-5分钟分钟 超顺磁珠超顺磁珠 标记生物素的抗体或抗原标记生物素的抗体或抗原 发光免疫分析基本操作步骤（二步法）发光免疫分析基本操作步骤（二步法） 待测样品待测样品 洗涤去除未结合的反应物洗涤去除未结合的反应物 发光底物发光底物 仪器检测仪器检测 反应管反应管 反应反应1010分钟分钟 反应反应0-50-5分钟

13、分钟 酶标记抗体或抗酶标记抗体或抗 原原 洗涤去除未结合的反应物洗涤去除未结合的反应物 反应反应1010分钟分钟 超顺磁珠超顺磁珠 标记生物素的抗体或抗原标记生物素的抗体或抗原 化学发光的应用 传染性疾病的检测：HBsAg、HBsAb、HBeAg 、HBeAb、HBcAb、anti-HCV、HIV等 甲状腺功能检测：TT3 、TT4 、T3 、T4 、TSH 糖尿病检测：INS、C-P等 肿瘤标志物检测：AFP、CEA、PSA、fPSA、 NSE、CA50、CA12-5、CA15-9、CA19-9等 性腺激素检测：E2、Testo、Prog、PRL、FSH 、LH、HCG 等 各品牌对比 类别

14、丰汇雅培罗氏贝克曼 方 法 学 检测 试剂 1.酶促化学发光 2.纯液相反应 3.通用型纳米免疫磁珠 4.亲和素-生物素免疫放大 系统 5.成熟的增强型鲁米诺发 光体系 1.吖啶酯直接化学发 光 2.半液相反应 3.非通用型磁珠，磁 珠上标记抗体（抗原 ） 1.电化学发光 2.纯液相反应 3.通用型纳米免疫磁珠 4.亲和素-生物素免疫放 大系统 1.酶促化学发光 2.纯液相反应 3.通用型纳米免疫磁 珠 4.亲和素-生物素免疫 放大系统 5.碱性磷酸酶发光体 系 仪 器 性 能 及 参 数 自动化 程度 真正的全自动无人伺候 真正的全自动无人伺 候 真正的全自动无人伺候 真正的全自动无人伺 候

15、 检测速 度 单机检测速度最快一步法 ：恒速400test/h；两步法 ：恒速200test/h，自测试 开始第16.5分钟出第一个 测试结果，以后每隔9秒 出一个结果 最高速度200 test/h最高速度180 test/h100 test/h 操作模 式 随机检测，急诊插入功能 随机检测，急诊插入 功能 随机检测，急诊插入功 能 随机检测，急诊插入 功能 反应杯 120个永久性免维护反应 杯 一次性塑料杯，成本 高 一次性塑料杯，成本高 一次性塑料杯，成本 高 各品牌对比(续上表） 丰汇雅培罗氏贝克曼 仪 器 性 能 及 参 数 加样方式 四智能加样手，各试剂独立加 样，杜绝交叉污染 智能

16、加样手智能加样手智能加样手 试剂位83个，超大独立冷藏双试剂盘独立冷藏试剂位独立冷藏试剂位独立冷藏试剂位 孵育方式 金属浴，温度控制随意可调， 精度达0.1度 金属浴金属浴金属浴 搅拌方式双独立搅拌手单独立搅拌手单独立搅拌手单独立搅拌手 可用方法 学 夹心法、竞争法、间接法、特 殊方法学可随机编辑 夹心法、竞争法 、间接法 夹心法、竞争法、 间接法 夹心法、竞争法、间接 法 最小反应 体积 100ul200ul200ul200ul 检测方法单光子计数单光子计数单光子计数单光子计数 灵敏度10pg/ml10pg/ml10pg/ml10pg/ml 一次性耗 材 无 有 5元/test 有 5元/test 有 5元/test