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1、第一章第一章光谱分析基础光谱分析基础l电磁辐射和电磁波谱l原子光谱和分子光谱l吸收、发射及散射光谱l仪器分析方法的评价l光谱分析在医学中的应用光学光谱分析构成物质的分子、原子或离子经辐射能照射后物质的总能量就会发生变化，在能量相互转化的过程中产生辐射信号或引起辐射信号变化。根据产生的辐射信号或引起信号变化，均可进行光谱分析以此实验手段为基础而建立分析方法的一门学科，广义上都称光谱分析法光谱分析以测定物质发射或吸收辐射的波长和强度为基础。三个基本过程：（1）能源(光源)提供能量；（2）能量与被测物之间的相互作用；（3）产生信号。三个基本特点：（1）所有光谱分析法均包含能量（光源）被测物（样品）及
2、信号；（2）对特定波长的谱线选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3）涉及大量光学元器件。一一电磁辐射电磁辐射1电磁辐射：高速穿过空间的一种能量，即光子流简称为光其最小单位是光子。光子的能量与其波长关系为：E=h=hc=hcc：光速2.99791010cms-1；：频率；E：能量；h：普朗克常数6.62610-34Js2产生一定能量的波长计算为：=hcEl3波长单位:m:1dm:0.1lcm:0.01mm:001m:10-6lnm:10-9pm:10-12.l不同波谱区的波长往往采用的单位不一样。l：波数：每厘米中所含波的数目，等于波长的倒数：=1。4普朗克观点：1），物质吸收或发
3、射辐射能量不连续的（量子化）。2），物质分子或原子发生能级跃迁时，产生的辐射能（吸收或发射的能量）完全等于两个能级之间的能量差。E=E1-E0=h=hc=hc因此，当物质发射电磁辐射或者电磁辐射被物质吸收时，就会发生能量跃迁。吸收或发射光的波长越短，跃迁时产生的能量差越大例：某电子在能量差为3.37510-19J的两能级间跃迁，其吸收或发射光的波长为多少纳米？解：根据上式，有=hcE=6.62610-34Js31010cms-13.37510-19J=5.8910-5cm=589nm5依外形可分线光谱(Linespectra):由处于气相的单个原子发生电子能级跃迁所产生的锐线，线宽大约为10-
4、5nm。带状光谱(Bandspectra):由气态自由基或小分子振动-转动能级跃迁所产生的光谱，由于各能级间的能量差较小，因而产生的谱线不易分辨开而形成所谓的带状光谱，其带宽达几个至几十个nm)；线光谱带光谱连续光谱(Continuumspectra)：包含各种波长的光，由炽热的固体、液体或高压气体所发的光都形成这种光谱。炽热的固体所产生的连续辐射是红外、可见及较长波长的重要辐射源，常用于做光谱分析的光源。由于固体被加热到炽热状态时，无数原子和分子的运动或振动产生热辐射，通常也产生背景干扰。二、电磁波谱1范围包括：射线无线电波所有范围。其中能为正常人视力感受到的电磁范围为可见光，其波长为（40
5、0780nm)按波长顺序排列得电磁波谱。各波谱区所具有的能量不同，其产生的机理也各不相同。下面列出了电磁波谱区的波长范围和相应能量及跃迁能级类型电磁辐射波谱图2，一般依其波长及其测定的方法可以分为：射线(0.0051.4)；X射线(0.1100)；光学光谱(1001000m)；微波波谱(0.1100cm)。l通常所说的光谱，一般仅指光学光谱而言。3单色光、复合光（1）单色光：具有同一波长（或频率）的光称为单色光。（2）复合光：由不同波长的光组合而成的光称为复合光。单色光很难从光源获得，多数光源如太阳、白炽灯和氢灯等发出的光都是复合光，通过适当的手段可以从复合光中获得单色光。三、光谱仪器组成：光
6、源，单色器，样品容器，检测器（光电转换器、电子读出、数据处理及记录）。光源或炽热固体样品容器分光系统光电转换信号处理器光源灯或激光样品容器分光系统光电转换信号处理器光源+样品分光系统光电转换信号处理器吸收荧光发射三种光分析法测量过程示意图1、光源对光源的要求：强度大（分析灵敏度高）、稳定（分析重现性好）。Laser=lightamplificationbystimulatedemissionofradiation2.分光系统（monochromatorwavelengthselector）定义：将由不同波长的“复合光”分开为一系列“单一”波长的“单色光”的器件。理想的100%的单色光是不可能达
7、到的，实际上只能获得的是具有一定“纯度”的单色光，即该“单色光具有一定的宽度（有效带宽）。有效带宽越小，分析的灵敏度越高、选择性越好、分析物浓度与光学响应信号的线性相关性也越好。构成：狭缝、准直镜、棱镜或光栅。入射狭缝准直镜物镜棱镜焦面出射狭缝f入射狭缝准直镜光栅物镜出射狭缝f其中最主要的分光原件为棱镜和光栅。3.试样装置：1）吸收池（Samplecontainer，Cell，Cuvette）盛放试样的吸收池由光透明材料制成。v石英或熔融石英：紫外光区可见光区；v玻璃：可见光区（350-2000nm）；v透明塑料：可见光区（350-2000nm）；v盐窗（NaClNaBr晶体）：红外光区。2）
8、其它特殊装置：将在原子光谱中详细介绍4.检测器：光电转换器（Transducer）1）将光信号转化为可以测量的电信号的器件。2）理想的光电转换器要求：灵敏度高；信背比SN大；暗电流小；响应快且在宽的波段内响应恒定。5.记录系统将电信号处理放大并以适当的方式显示或记录下来，如计算机处理。四原子光谱和分子光谱1，原子光谱原子中价电子处于能级最低能量状态时，称基态。按受外界能量后(如受到光的照射)，电子跃迁到较高或更高能级状态，称激发态。基态与激发态之间能量差E120eV，即光子能量。当原子核外电子在不同能级态跃迁时，产生的光谱就叫原子光谱。l原子光谱为线状光谱，每条谱带对应于一定的波长。其波长负载
9、了特定元素原子的分析信息，作定性分析依据。谱带的强度则往往与样品中原子浓度大小有关，作为定量分析依据。2，分子光谱(molecularspectrum)：在辐射能作用下分子内能级间的跃迁产生的光谱，称为分子光谱。分子光谱包含几种不同能量的谱线：电子光谱，振动光谱，转动光谱（详细内容在紫外吸收可见光谱一节讨论）分子光谱法就是以测量分子转动能级、振动能级（包含转动）及电子能级（包含振、转）跃迁时的谱线为基础定性定量分析物质分子结构的方法。除转动光谱外，其它分子光谱皆为许多谱线聚集成的带状光谱。五.吸收、发射及散射光谱1吸收光谱:当物质所吸收的电磁辐射能与该物质的原子核、原子或分子的两个能级间跃迁所
10、需的能量满足E=hv的关系时，将产生吸收光谱。M+hvM通过测量物质的吸收光谱的波长和强度进行定性和定量分析的方法叫做吸收光谱分析。包括原子吸收、紫外可见、红外吸收等。lllllll。l2发射光谱l物质通过电、热或光获得能量，其粒子(原子离子或分子)从基态或低能态变为高能态原子或分子M.高能态粒子又迅速回到低能态或基态时释放能量从而产生发射光谱(emissionspectrum）。lMM+hvl通过测量物质的发射光谱的波长和强度进行定性和定量分析的方法叫做发射光谱分析法。l包括原子发射和荧光光谱3荧光光谱某些物质的分子或原子在辐射能的作用下跃迁至激发态，在返回基态的过程中，先以无辐射跃迁的形式
11、释放出部分能量，回到第一激发态，然后再以辐射跃迁回到基态，由此产生的光谱称为荧光光谱。荧光光谱实质是一种发射光谱。由原子产生的荧光光谱称为原子荧光光谱；由分子产生的荧光光谱称为分子荧光光谱。l4散射光谱l当物质分子吸收了频率较低的光能后，并不足以使分子中的电子跃迁到电子的激发态，而只是上升到基态中较高的振动能级上去，若在10-15s10-12s返回到原能级，此时辐射出和激发光相同波长的光，称为瑞利散射；若返回到较原能级稍高或稍低的振动能级上，辐射出较激发光波长稍长或稍短的光，称为拉曼散射。六仪器分析方法的评定l要达到准确测量的目的，必须了解所用分析方法的可靠性与适用性，严格控测定条件，对分析方
12、法的准确度，精密度，检测下限，分析空白，线性范围，基体效应环境因素等方面作出评定1精密度标准偏差(standarddeviationS)对于微量或痕量物质分析，标准偏差更能突出较大偏差的影响。相对标准偏差(RSD)或称变异系数仪器分析工作中都用RSD表示分析结果的精密度。l2准确度：通常用绝对误差或相对误差表示。l表示方法（X：测量值：真值）l(1)绝对误差:()=Xl(2)相对误差(R)=100%l通过多次测量已知浓度或含量的物质（称为标准物质），得到总体平均值与标准物质含量（真实值）比较。含量1%，准确度较差；含量在0.1%1%，其准确度与化学分析法近似；含量在0.001%0.1%或更低时
13、，其准确度优于化学分析法。故光谱分析适于微量和痕量分析3灵敏度（Sensitivity）反映仪器或方法识别微小浓度或含量变化的能力。影响灵敏度的因素有二：a）校正曲线的斜率；b)分析的重现性或精密度。国际纯粹与应用化学联合会，即IUPAC推荐使用“校正灵敏度”或者“校正曲线斜率”作为衡量灵敏度高低的标准。010203040506000.10.20.30.40.50.6ScS2=k2c+Sblank-2S1=k1c+Sblank-1仪器和方法的灵敏度描述k1k2分别为两条校正曲线的斜率，即灵敏度。未考虑测定重现性影响4检出限（DetectionlimitDL）检出限：在已知置信水平，可以检测到的
14、待测物的最小质量或浓度。它和分析信号（Singnal）与空白信号的波动（噪音Noise）有关，或者说与信噪比（SN）有关。只有当有用的信号大于噪音信号时，仪器才有可能识别有用信号，如下图所示。所谓检出，即判定样品中存有浓度高于空白的待测物质。sb测定次数，nSSDL=Sb+k1sb仪器噪音及方法检出限K1=3时，可以认为仪器检出的最小信号值SDL可能性为95%检出限的计算1测定空白样品(或浓度接近空白值）20-30次，求其平均值Sb及其标准偏差sb，则可分辨的最小信号SDL=Sb+k1sb2通过校正曲线的斜率k，将最小待测物信号SDL转化为浓度值CDL，即3经统计学的t和z检验，当k1=3时，
15、大多数情况下，检测结果的置信度为95%。因此上式可转换为：动态范围CDLLOLLOQ浓度，c响应信号S5线性范围（Dynamicrange）CDL=检出限；LOQ(limitofquantitation)定量下限LOQ=10sblankLOL=limtoflinearresponse定量上限（能准确地定量测定待测物质的最大浓度或量）。线性范围是指信号与样品浓度呈线性的工作曲线直线部分l通常把相当于10倍空白的标准偏差相应的浓度定为方法的线性范围的定量检测下限。取工作曲线中高浓度时，弯曲处作为方法的线性范围的定量检测上限。好的分析方法要有宽的线性范围。有的分析方法线性范围只有一个数量级，有的分析
16、方法线性范围可达56个数量级。同一分析方法可用常量、微量、痕量的物质分析。6仪器分析校正方法所谓校正(Calibration)，就是将仪器分析产生的各种信号与待测物浓度联系起来的过程。校正方法有三：标准曲线法；标准加入法；内标法。1）标准曲线法（Calibrationcurve，WorkingcurveAnalyticalcurve）具体做法：a)准确配制已知待测物浓度的系列:0(空白)，c1，c2，c3，c4.；b)通过仪器分别测量以上各待测物的响应值S0，S1，S2，S3，S4及待测物的响应值Sx；c)以浓度c对响应信号与S作图得到标准曲线，然后通过测得的Sx从下图中求得cx；或者通过最小二乘法获得其线性方程再直接进行计算。S440cx标准曲线法的准确性与否与两个因素有关：标准物浓度配制的准确性；标准基体与样品基体的一致性。0.0520浓度，cSS2S3S10.00.20.40.60.81.01.230Sx2）标准加入法（Standardadd
