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1、文件类别：技术标准 28/25文件名称： 微生物限度检查法(二部)检验标准操作规程 文件编号：09T-I636-01分发部门：质量控制科1. 目的：建立微生物限度检查法(二部)检验标准操作规程，并按规程进行检验，保证检验操作规范化。2. 依据： 2.1. 中华人民共和国药典2010年版二部。3. 范围：适用于所有用微生物限度检查法(二部)测定的供试品。4. 责任：检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。5. 正文：5.1. 简述：5.1.1. 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。5.1.2. 微
2、生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。5.1.3. 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。5.1.4. 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为3035，霉菌、酵母菌培养温度为2328。5.1.5. 检验结果告以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位
3、报告。5.2. 检验量。5.2.1. 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml 或 cm2）。5.2.2. 除另有规定外，一般供试品的检验量为10 g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。5.2.3. 检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。5.2.4. 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。5.3. 供试液的制备5.3.1. 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用加温时，
4、应均匀加热，且温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。5.3.2. 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。5.3.2.1. 液体供试品：取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。5.3.2.2. 固体、半固体或黏稠性供试品：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。5.3.
5、2.3. 需用特殊方法制备供试液的供试品5.3.2.3.1. 非水溶性供试品。5.3.2.3.1.1. 方法1：取供试品5g(或5ml)，加至含溶化的（温度不超过45）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20的供试液。5.3.2.3.1.2. 方法2：取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录XI H无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后
6、加入45 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇510分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。5.3.2.3.2. 膜剂供试品：取供试品100cm2，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1：10的供试液。5.3.2.3.3. 肠溶及结肠溶制剂供试品：取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂) pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45水浴中，振摇，使溶解，作为1：10的供试液。5.3.2.3.4. 气雾剂、喷雾剂供试品：取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，
7、迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。5.3.2.3.5. 贴剂供试品：取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯 80 或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少 30 分钟，制成供试液。贴剂也可采用其他适宜
8、的方法制备成供试液。5.3.2.3.6. 具抑菌活性的供试品：当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性，再依法检查。常用的方法如下。5.3.2.3.6.1. 培养基稀释法：取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时， 取同稀释级的供试液2ml ，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。5.3.2.3.6.2.
9、离心沉淀法：取一定量的供试液，500转/分钟离心3分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。5.3.2.3.6.3. 薄膜过滤法：见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。5.3.2.3.6.4. 中和法：凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。5.4. 细菌、霉菌及酵母菌计数。5.4.1. 计数培养基的适用性检查。 5.4.1.1. 细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。5.4.2. 菌种。5.4.2.1. 试验用菌株的传代次数不得超
10、过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 0035.4.3. 菌液制备。5.4.3.1. 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培
11、养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养 1824 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养 2448 小时。上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50100cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养 57 天，加入 35ml 含 0.05（ml/ml）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05（ml/ml）聚山梨酯 80 的 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数 50100cfu 的孢子悬液。5.4.3.2. 菌液制备后
12、若在室温下放置，应在 2 小时内使用，若保存在 28，可在 24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 28，在验证过的贮存期内使用。5.4.4. 适用性检查：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各 50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，混匀，凝固，置3035培养 48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各 50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，混匀，凝固，置 2328培养 72 小时，计数；取白色念珠菌 50100cfu， 注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，
13、平行制备 2 个平皿， 混匀，凝固，置 2328培养 72 小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。5.4.5. 结果判定：若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。5.4.6. 计数方法的验证。5.4.6.1. 当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。5.4.6.2. 验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌
14、计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。5.4.7. 菌种及菌液制备。5.4.7.1. 同计数培养基的适用性检查。5.4.8. 验证方法：验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。5.4.8.1. 试验组：平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。5.4.8.2. 菌液组：测定
15、所加的试验菌数。5.4.8.3. 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。5.4.8.4. 稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50100cfu ，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。5.4.9. 结果判断5.4.9.1. 在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的菌数回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法（常见干扰物的中和剂或灭活方法见表 1）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。表 1 常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛亚硫酸氢纳酚类、乙醇、吸附物稀释
