层析分离技术教材

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1、色谱分离方法色谱分离方法色谱分离方法 2 1903年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3固体粉末装入竖 立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用 石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因 此，Tsweet把这种方法称为色谱法。 色谱法的发展 在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的 发明。 1931年：德国的Kuhn和Lederer在Tswett实验的基础上用氧 化铝和碳酸钙分离了-，-，和-胡萝卜素，此后用这种方法分 离了60多种这类色素。 1940年：Martin和Synge提出液-液分配色谱法（Liquid- Liquid Partion C

2、hromatography）,即固定相是吸附在硅胶上的 水，流动相是某中有机溶剂。 1941年Martin和Synge提出用气体代替液体流动相的可能 性。 1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液 色谱方法（Gas-Liquid Chromatography），因而获得了1952年 的诺贝尔化学奖。 1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open-Tubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管气相色谱法（ Capillary Column Chromatography）。 1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了

3、描述色谱 过程的速率理论，1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理 论，为色谱的发展奠定了理论基础。 1944年Consden等就发展了纸色谱。 1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合计制作薄层板使 薄层色谱（TLC）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层 色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。 20世纪60年代末，把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱 ，出现了高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography）。 20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱得到发展，但在90年 代后未得到较广泛应用。 20世纪80年代初

4、由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细 管电泳，在90年代得到广泛的发展和应用。同时集高效液相色谱 和毛细管电泳优点的毛细管电色谱在90年代后期受到重视。 21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥它不可替代 的重要作用。 v如今，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色 物质的分离。所以色谱法已经失去原来的含义。但是，现在 仍沿用色谱法这个名称。 v色谱法具有分离及分析两种功能。它是分析混合物最有力的 手段。 v色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油 化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦 查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种

5、分离分析课题。 什么是色谱法？ 色谱法是一种分离、分析方法，有时又称为层析技术。 它利用被分离的诸物质在互不相溶的两相中分配系数等的微 小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相 之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大 的效果，形成差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分 离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。 两种组分的理化性质原本存在着微小的差异，经过反复多 次地吸附解吸再吸附再解吸的过程使微小差异累积起来 ，结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱，吸附能力强的组分 后流出色谱柱，从而使各个组分得到了分离。 吸附解吸再吸附再解吸 色谱过程 包括两相（即固定相

6、、移动相）和样品。 固定相 在色谱过程中不发生移动。 材料：固体（相）、固体及其所支持的液体。 流动相 在色谱过程中不停地移动，并带动被分 离物质一起移动。 材料：气体、液体。 样 品 溶质 色色谱体系谱体系 9 色谱法的特点和优点色谱法的特点和优点 1 1色谱法的特点：色谱法的特点： 与经典的分离提纯手段（重结晶，升华，萃取与经典的分离提纯手段（重结晶，升华，萃取 和蒸馏等）相比，色谱法具有快速，简便和高效和蒸馏等）相比，色谱法具有快速，简便和高效 率等优点。并能对复杂化合物，甚至立体异构体率等优点。并能对复杂化合物，甚至立体异构体 进行分离。进行分离。 液相色谱（含柱，薄层色谱）适合于固体

7、物质液相色谱（含柱，薄层色谱）适合于固体物质 和具有高蒸汽压的油状物的分离，不适合低沸点和具有高蒸汽压的油状物的分离，不适合低沸点 液体的分离。液体的分离。 气相色谱适合于容易挥发物质的分离。气相色谱适合于容易挥发物质的分离。 10 色谱法的特点和优点色谱法的特点和优点 2 2色谱法的优点色谱法的优点 （1 1）分离效率高。）分离效率高。 （2 2）应用范围广。）应用范围广。 （3 3）分析速度快。）分析速度快。 （4 4）样品用量少。）样品用量少。 （5 5）灵敏度高。）灵敏度高。 （6 6）分离和测定一次完成。可以和多种波谱分析仪）分离和测定一次完成。可以和多种波谱分析仪 器联用器联用 （

8、7 7）易于自动化，可在工业流程中使用。）易于自动化，可在工业流程中使用。 色谱法色谱法的分类的分类（依据不同,分发不同） （1）按两相的状态分类 开床式色谱 纸色谱（利用滤纸作固定相的支持物，把试 样点在滤纸上，用溶剂将其展开而进行分 离） 薄层色谱（用粉末吸附剂，压成或涂成薄层 ，然后用类似纸色谱的操作进行分离） （2）按分离“床”的几何形状分类 柱色谱 （3）按分离原理分类 吸附色谱：利用吸附剂表面对不同组分具有的不同吸附 能，达到分离目的。 分配色谱：利用不同组分在给定的两相中具有不同的分配 系数而使混合物实现分离与测定的方法。 离子交换色谱：以带固定电荷的离子交换剂作固定相，用 于分

9、离带相反电荷的物质。由于不同物质带电情况不同 而对固定相有不同的静电力而进行分离 。 凝胶色谱：又叫体积排阳色谱，分子筛色谱。以多孔的固 体凝胶作固定相，分子大小不同的物质因进入固定相孔 内的程度不同而达到分离的目的。 亲和色谱：根据固定相上键合的特殊配体对某种生物大分 子有专一性吸附而除去其他杂质。使生物大分子得以分 离。 （4）按使用领域不同对色谱的分类： 分析型色谱：主要用于各种样品的分析，其特点 是色谱柱较细，分析的样品量少。 制备型色谱：又可分为实验室用制备型色谱和工 业用大型制造纯物质的制备色谱。 色谱分离的基本原理色谱分离的基本原理 v利用待分离的各种物质在两相中的分配系 数、

10、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。 色谱法的基本原理 v色谱法是包括一大类操作方式不同、但分离原理相同的一 门技术，不论采用何种方法或设备、其色谱过程有着如下 共同点：（1）任何色谱过程，都必须有两相物质存在， 一为固定相，一为流动相。（2）物质的分离还必须借助 于流动相相对于固定相移动。（3）被分离的物质称为溶 质，由于各种溶质组分与两相物质有着不同作用力，从而 造成各组分产生差速运动而达到分离目的。 v溶质与两相物质之间作用力可以为吸附力，也可以为溶解 力；由于此种力之不同，决定了各个组分在两相中有着不 同量或浓度的分布，随着流动相的前移，则此种分布不断 变更，最终与流动相作用力大的组

11、分前移快，反之则慢。 下图为一二元组分分离示意图。 分 离 原 理 v在色谱分析中，当流动相携带样品通过色谱 的固定相时，样品分子与固定相分子之间发 生相互作用，使样品分子在流动相和固定相 之间进行分配。与固定相分子作用越大的组 分向前移动速度越慢，与固定相分子作用越 小的组分向前移动速度越快，经过一定的距 离后，由于反复多次的分配，使原本性质（ 沸点、极性等）差异很小的组分之间可得到 很好的分离。 离子交换色谱法 v离子交换色谱法(ion exchange chromatography，IEC)是利用 离子交换树脂为固定相，以适宜的溶剂作 为移动相，使溶质按它们的离子交换亲和 力的不同而得到

12、分离的方法。 与离子交换法的区别？ 离子交换法：应用离子交换剂作为吸附剂，通过静 电引力将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂 上，然后用合适的洗脱剂将吸附物从离子交换剂上洗 脱下来，从而达到分离、浓缩、纯化的目的。 离子交换色谱法：利用离子交换树脂作为固定相，以适宜的溶剂作为流动相，使溶 质按它们的离子交换亲和力的不同而得到分离的方法。 利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离 方法。 一、基本原理 v离子交换色谱是指带电物质因电荷力作用 而在固定相与流动相之间分配得以相互分 离的技术。蛋白质等两性电解质。当 pH pI 时，蛋白质带净负电荷。由于各种蛋白质

13、 等生物大分子的等电点不同，可以通过改 变溶液的pH和离子强度来影响它们与离子 交换树脂的吸附作用，从而将它们相互分 离开来。 离子交换的基本过程： v(1) 初始稳定状态 v(2) 离子交换过程 v(3) 洗脱过程 v(4) 介质的再生过程 a bcde 离子交换的基本过程： 离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有 机溶剂的固体高分子聚合物。它具有网 状立体结构并含有活性基团，能与溶剂 中其他带电粒子进行离子交换或吸着。 二、离子交换树脂 1.定义 交换树脂表面 操作方法 v1. 离子交换剂的处理 v2. 装柱及上样 v装柱主要是防止出现气泡和分层，装填要 均匀。防止产生气泡和分层的方法是装柱

14、时柱内先保持一定高度的起始洗脱液(一般 为柱高的1/3)，加入树脂时使树脂借水的 浮力慢慢自然沉降。装柱完毕后，用水或 缓冲液平衡到所需的条件，如特定的pH、 离子强度等。 上样 v加压法是采用打气入柱的方式进行加 压，可用一个装有样品的分液漏斗与 柱用橡皮塞连接，分液漏斗上端串有 压力剂并经缓冲瓶与打气管相连，当 达到所需压力时就将打气管夹紧。减 压法是在柱的排出口增设抽气装置， 工业上多采用此法。 3.洗脱 v分离不同的物质选用不同的洗脱剂。原则 是用一种更活泼的离子把交换在树脂上的 物质再交换出来。常用的洗脱剂为酸类、 碱类或盐类溶液，改变整个系统的酸碱度 和离子强度，以使交换物质的交换

15、性能发 生变化，己交换上的物质就逐渐被洗脱下 来。为了提高分辨率，常采用剃度洗脱 法。 发展趋势 v分析测定食品及生物样品中有机酸 v研究蛋白质与RNA的结合特异性 v分离稀土元素及镥、镱、铥的测定 v分离重金属离子及铜和锌的测定 凝胶色谱法 v凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分 离的一种分离技术，又称之凝胶过滤、 凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散 层析或排阻层析。它具有一系列的优点 ：操作方便、不会使物质变性、适用于 不稳定的化合物、凝胶不用再生、可反 复使用。缺点：分离速度较慢。 一、基本原理 v小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散 外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进 入凝胶相内，在向

16、下移动的过程中，从一 个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝 胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子 物质的下移速度落后于大分子物质，从而 使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分 子的后流出，分子最小的最后流出，这种 现象叫分子筛效应。 凝胶过滤层析过程示意图 小分子 大分子 凝胶基质 凝胶 珠 二、凝胶过滤介质 v理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及 化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸 强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范 围窄，珠粒颗粒大小均一度高。目前， 常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚 丙烯酰胺凝胶等。 三、操作方法 v1. 凝胶的预处理 v市售凝胶必须经过充分溶涨后才能使 用，如果溶涨不充分，则装柱后凝胶 继续溶涨，造成填充层不均匀，影响 分离效果。在烧杯中将干燥凝胶加水 或缓冲液，搅拌、静置、倾去上层混 悬液、除去过细的粒子。如此反复多 次，直至上层澄清为止。 2. 层析柱的选择 v层析柱的体积和高径比与层析分离效果的 关系相当密切。层析柱的直径大小不影响 分离度，样品用量大，可加大柱的直径。