《胰腺癌中survivin的表达意义及rnai对panc1细胞凋亡和化疗敏感性影响的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胰腺癌中survivin的表达意义及rnai对panc1细胞凋亡和化疗敏感性影响的研究（110页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中南大学 博士学位论文 胰腺癌中survivin的表达意义及RNAi对PANC-1细胞凋亡和化疗 敏感性影响的研究 姓名：陈俭云 申请学位级别：博士 专业：普通外科学 指导教师：李宜雄 20090501 博士学位论文 摘要 【目的】胰腺癌对绝大部分化疗药物耐药。存活素( s u r v i v i n ) 基因 是凋亡抑制蛋白家族成员中抑制凋亡作用最强的一种，在大部分恶性 肿瘤组织和细胞中高表达，是肿瘤增殖和化疗耐药的重要因子。本研 究的主要目的有：( 1 ) 探讨s u r v i v i n 在胰腺癌组织中的表达及其与临 床病理的关系。( 2 ) 观察胰腺癌细胞株P A N C 1 中s
2、u r v i v i n 的表达及 其在化疗药物吉西他滨作用后的变化。( 3 ) 运用R N A i 载体抑制 s u r v i v i n 的表达对诱导P A N C 1 细胞凋亡的影响。( 4 ) R N A i 抑制 s u r v i v i n 的表达对增加化疗药物吉西他滨化疗敏感性的影响。为探索 胰腺癌新的治疗方法奠定实验基础。 【方法】( 1 ) 运用免疫组化法检测3 5 例胰腺癌手术切除标本和 l O 例癌旁胰腺组织，分析s u r v i v i n 的表达和临床病理特征的关系。( 2 ) 培养胰腺癌细胞P A N C 1 ，加入吉西他滨，运用R T - P C R 和W
3、 e s t e r nb l o t 检测s u r v i v i n 的表达。( 3 ) 构建以U 6 为启动子的R N A i 载体并转染 黝N C 1 ，运用R T - P C R 和W e s t e r nb l o t 检测s u r v i v i n 的表达，F C M 检 测凋亡指数和H o e c h e s t3 3 2 5 8 检测凋亡形态。( 4 ) M T T 、F C M 和 H o e c h e s t3 3 2 5 8 检测P A N C 1 对化疗药物吉西他滨的敏感性。 【结果】( 1 ) 免疫组化显示胰腺癌组织中有s u r v i v i n 的阳
4、性表达， 而癌旁组织中无s u r v i v i n 的表达。胰腺癌组织中其表达的阳性率 ( 2 6 3 5 ，7 4 2 9 ) 1 t f J , 显高于癌旁组织( 0 1 0 ，O ) ，差异有统计学意义( 尸 0 0 5 1 5 博十学位论文第部分G m e i t a b i 嘴诱导胰腺癌细胞P A N C - l 中s 州i v i n 基目寝达的研究 2 2 2s u r v i v i nm R N A 的表达情况 以G A D P H 的获度值为内参照比较目的基因s u r v i v i n 与G A P D H 条带灰 度的比值( 图2 - 1 ) 。1u g m l2
5、 4 h ( A ) 组，1 0 I t g m l2 4 h ( B ) 组，I p g m l4 8 h ( C ) 组，1 0 9 9 m l 4 8 h ( D ) 组，较空白对照( E ) 组上升分别为( 13 4 ：t o l 2 ) 倍、( 24 0 i - 0 1 7 ) 倍、( 33 3 ：02 0 ) 倍和( 44 1 = I - 01 8 ) 倍，差异均有统计学意义( P O0 5 ) ，C 1 ，B 比较，D 与B 比较，C 与D 比较，差异均有统计 学意义f P O0 5 ) ，c 组与B 组比较差芹有统计学意义俨 o0 5 ) 。 ( 1 2 0 0 ) 空白对照组
6、 B ( 3 2 0 0 ) 转染P 鲫e s l l u l 质粒组 C ( 3 2 2 0 0 ) 转染P g e n e s i l s u 时) 质粗组 田3 P A N C - IH o e c h s t 3 3 2 5 8 形态学和凋亡细胞计数( 4 伽l 博士学位论文第三部分运用R N A i 技术抑制s u r v i v i n 的表达对P A N C 1 细胞凋亡影响的研究 3 3 讨论 3 3 1R N A i 及其作用机制 R N A i ( R N Ai n t e r f e r e n c e ，R N A 干扰) 是一种在动物或植物细胞内的双链R N A ，
7、会导致细胞内与其同源的m R N A 发生转录或转录后或翻译不同水平的基因沉默 机制，R N A i 技术是一种新的高效特异的使基因沉默的方法。1 9 9 0 年，J o r g e n s e n 等【删在对矮牵牛花( p e t u n i a s ) 的研究中，将一个能产生色素的C H S 基因过表达，试 图获得更多紫颜色的花朵，结果是产生了更多白颜色的花朵。这种现象被称为协 同抑带1 J ( c o s u p p r e s s i o n ) 。这是R N A i 现象的最早发现。1 9 9 5 年，G u o 掣4 7 1 发现用反 义R N A 能阻断线虫( c e l e g
8、 a n s ) p a r - 1 基因的表达，但奇怪的是，作为对照的正义链 R N A ，也同样阻断了该基因的表达，当时未能给出合理的解释。1 9 9 8 年，F i r e 等 【4 8 】解释了这一现象，正义R N A 对基因表达的抑制以及过去利用反义R N A 技术对 基因表达的阻断，都是由体外转录制备的R N A ( 包括正义R N A 和反义R N A ) 中污染 的微量双链R N A ( d o u b l e s t r a n d e dg N A , d s K N A ) 所引起。并首次将d s R N A ( 正义链 和反义链的混和物) 注入线虫，结果诱发了比单独注射
9、正义链或反义链都要强得 多的基因沉默。双链R N A 能够以同源互补序列的m R N A 为靶目标降解特定的 m R N A ，这种特异性和选择性抑制靶基因表达的过程称为R N ( R N 忏扰) 。随后， R N A i 在植物、真菌、水媳、涡虫、线虫、锥虫、斑马鱼、果蝇、酵母、植物、 哺育动物等许多生物中被发现。2 0 0 2 年，P a d d i s o n 等【4 9 】发现了短发夹 R N A s ( s h R N A s ) ，可以在细胞内产生内源性的s i R N A 从而提供稳定的、可遗传的 基因沉默，并命名这种效果为短发夹活化的基因沉默( s h o r t - h a
10、i r p i n a c t i v a t e dg e n e s i l e n c i n g ，S H A G g i n g ) 。因此断定R N A i 是一种生物体内广泛存在的基因调控机制。 早期研究证实R N A i 是通过核酸酶作用的酶解过型5 0 1 包括以下几个步骤：( 1 ) d s R N A 的识别和出现。包括由外源导入或者由转基因、转座子、病毒感染等各种 方式引入的d s R N A ；( 2 ) d s R N A 毛E 具有R N a s e l I I 样活性的d s R N A 特异性核酸内切 酶( d s R N As p e c i f i ce
11、n d o n u c l e a s e ，D i c e 0 作用下，被切割为2 1 2 3 核苷酸 ( n u c l e o t i d e ，n t ) 长的小分子干扰R N A 片段( s m a l li n t e r f e r i n gR N A s ，s i g N A ) 。s i R N A 不仅是d s R N A 和靶R N A 的降解产物，而且也是R N A i 过程中核酸酶的引物；( 3 ) R N A 诱导沉默复合物( g N Ai n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x , R i s e ) 形成。每个R I
12、 S C 包含 1 个s i R N A 与1 个不同于D i c e r 的R N A 酶；( 4 ) s i R N A 双链解开，R I S C 被活化；( 5 ) 3 1 博士学位论文第三部分运用R N A i 技术抑制s u r v i v i n 的表达对P A N C 1 细胞凋亡影响的研究 活化的R I S C 与A r g o n a u t e 2 等相关的蛋白结合，通过碱基配对识别互补的靶m R N A 并在s i R N A 3 端1 2 个碱基的位置切割靶m R N A ，从而干扰基因表达。双链R N A 在 R d R P 作用下，形成新的双链R N A 。新产生的
13、d s R N A 片断可再次形成R I S C ，继续 降解m R N A ，从而产生级联放大效应。因此，少量的双链I 蝌A 即可引起高效的基 因敲除效果。 近年来研究发现，在转录水平和翻译水平上也发现了R N A i 的作用机制。可 能通过启动子内甲基化等诱导靶基因的染色质结构改变，使靶基因的转录受阻； 或者抑制靶m R N A 的翻译，使靶蛋白表达受阻。 3 3 2 制备s i R N A 的方法 目前制备s i R N A 的方法主要有5 种：体外化学合成法，体外转录法，体外 用R N a s e l I I 消化长片断双链R N A 制备法，体内s i R N A 表达载体合成法和体
14、内 s i R N A 表达框架法。 本研究应用的靶向s u r v i v i n 的s i R N A 载体即是按第4 种方法，应用含有U 6 启动子的P g e n e s i l 一2 载体构建而成，体外研究显示s u r v i v i ns i R N A 质粒可明显下 调胰腺癌细胞P A N C 1 中s u r v i v i n 的表达，促进细胞凋亡。本实验前，重组的 s u r v i v i ns i R N A 质粒P g e n e s i l s u r ( + ) 经扩增大量制备并经测序鉴定，以确证插入模 板序列位置的正确性，保证质粒载体的功能稳定，这就为本实验利
15、用R N A i 技术 研究s u r v i v i n 基因的功能提供了保障。本实验所参考K a p P l e r 等【4 5 1 的序列己证实 对多种肿瘤细胞有效【”l 。我们的实验亦证实该序列对胰腺癌有效，提示该序列可 能具有通用性，可以作为研究靶向s u r v i v i n 的R N A i 时优先考虑的序列。 3 3 3 质粒转染的方法 将基因导入真核细胞的方法有多种，转染是通过生化或者物理方法将目的基 因导入真核细胞中。目前的方法分包括磷酸钙共沉淀法，电穿孔法以及同D E A E 葡聚糖或阳离子脂质体试剂形成复合物法等。在这些不同的方法中，D N A 转导 的效率，转导的机
16、制，可重复性及使用的方便性都存在差异。本研究为了保证通 过阳离子脂质体介导有效地将外源质粒D N A 分子转染P A N C 1 细胞并表达外源 蛋白，利用表达绿色荧光蛋白G F P 的质粒p E G F P N l 优化转染条件。p E G F P N l 质粒含有G F P 基因，若能有效导入细胞并表达，可产生发出绿色荧光的G F P 蛋 3 2 博士学位论文第三部分运用R N A i 技术抑制s m v i v i n 的表达对P A N C 1 细胞凋亡影响的研究 白，能够在荧光显微镜下较直观的观察到外源蛋白的表达。本实验中发现 p E G F P N l 质粒与L i p o f e c t a m i n e r U 2 0 0 0 按l ：2 5 ( 1 t g ：山) ，5 0 山体积时转染效率 最高，约为7 0 “ - - 8 0 ，2 4 h 后荧光显微镜下观察到大量表达绿色荧光蛋白细胞， 说明实验所用转染试剂L i p o f e
