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1、医学微生物学的新挑战医学微生物学的新挑战2012 (2)2012 (2)OUTLINE微生物学发展简史微生物学发展简史感染性疾病与人类感染性疾病与人类自动化仪器的进展自动化仪器的进展分子生物学在微生物检验中的应用分子生物学在微生物检验中的应用 细菌鉴定及分类细菌鉴定及分类 耐药性检测耐药性检测病毒变异的临床意义病毒变异的临床意义列文虎克观察到的微生物列文虎克观察到的微生物2 2、微生物生理学时期、微生物生理学时期 建立了一套独特的研究方法建立了一套独特的研究方法, ,寻找各种传染寻找各种传染病病原菌病病原菌巴斯德在观察受狂巴斯德在观察受狂犬病感染的兔脊髓犬病感染的兔脊髓巴斯德在工作中巴斯德在工
2、作中著名的巴斯德研究院著名的巴斯德研究院巴斯德在微生物学上的贡献巴斯德在微生物学上的贡献有机物发酵和腐败由微生物引起有机物发酵和腐败由微生物引起解决葡萄酒和啤酒变酸问题解决葡萄酒和啤酒变酸问题创立巴氏消毒法创立巴氏消毒法解决蚕茧的解决蚕茧的“ “微粒子病微粒子病” ”的疾病，挽救了法国蚕丝的疾病，挽救了法国蚕丝业业主张传染病是由微生物引起的，并可通过接触、唾主张传染病是由微生物引起的，并可通过接触、唾液及粪便传播液及粪便传播1919世纪世纪7070年代，研究炭疽病，拯救了畜牧业年代，研究炭疽病，拯救了畜牧业18811881年研制成功减毒活疫苗年研制成功减毒活疫苗开创人类战胜传染病开创人类战胜传
3、染病的新世纪的新世纪18851885年，巴斯德第一次治好了被疯狗咬伤的年，巴斯德第一次治好了被疯狗咬伤的9 9岁男岁男孩梅斯特孩梅斯特奠定了免疫学基础奠定了免疫学基础微生物方法学和医学微生物学奠基人微生物方法学和医学微生物学奠基人科赫科赫 科赫科赫18821882年发现引起结核病的病原年发现引起结核病的病原分离出结核分离出结核杆菌杆菌创立了微生物学检查方法：固体培养技术、创立了微生物学检查方法：固体培养技术、染色技术、实验动物感染染色技术、实验动物感染发现炭疽杆菌、霍乱弧菌发现炭疽杆菌、霍乱弧菌总结了著名的总结了著名的“ “科赫法则科赫法则” ”-确立病原微生确立病原微生物物19051905年
4、获得了诺贝尔医学和生理学奖年获得了诺贝尔医学和生理学奖分离细菌的固体培养基分离细菌的固体培养基KochKoch氏确定病原体四要点氏确定病原体四要点在每一例患病的病人中，都应找到此种微生物在每一例患病的病人中，都应找到此种微生物该微生物能被分离，且能在纯培养基中生长该微生物能被分离，且能在纯培养基中生长培养出的微生物接种于易感动物，一定能导致培养出的微生物接种于易感动物，一定能导致动物产生该病动物产生该病在实验性发病动物中，一定能观察并重新获得在实验性发病动物中，一定能观察并重新获得此种微生物此种微生物李斯特在石炭酸喷雾下进行手术李斯特在石炭酸喷雾下进行手术 李斯特李斯特 无菌操作奠基人无菌操作
5、奠基人伊凡诺夫斯基伊凡诺夫斯基 病毒的发现者病毒的发现者欧立希欧立希 （Ehrlich） 1910年砷凡纳明抗梅毒年砷凡纳明抗梅毒药的发现者药的发现者1929年青霉素发现者弗莱明年青霉素发现者弗莱明1940年弗洛瑞提纯应用于临床年弗洛瑞提纯应用于临床弗莱明弗莱明 研究微生物的生命活动研究微生物的生命活动DomagkDomagk发现黄胺药发现黄胺药GriffithGriffith发现细菌转化现象发现细菌转化现象新病原微生物的确定方面新病原微生物的确定方面19741974年从莱姆年从莱姆(Lyme)(Lyme)病患者分得疏螺旋体病患者分得疏螺旋体19761976年在美国费城一次退伍军人会议期间发生
6、年在美国费城一次退伍军人会议期间发生 肺炎流行肺炎流行, ,次年分离出军团菌次年分离出军团菌19831983年从慢性胃炎病人活检标本中分离出年从慢性胃炎病人活检标本中分离出 幽门螺杆菌幽门螺杆菌现代微生物学时期现代微生物学时期二十世纪中叶至今二十世纪中叶至今 19861986年我国台湾省分离得肺炎衣原体年我国台湾省分离得肺炎衣原体 19831983年首先在美国发现人类免疫缺陷病毒年首先在美国发现人类免疫缺陷病毒 （HIVHIV） 近期新发现的病毒有肾综合征出血热病毒、新近期新发现的病毒有肾综合征出血热病毒、新疆出血热病毒、疆出血热病毒、B B 组轮状病毒、丙型肝炎病毒和组轮状病毒、丙型肝炎病毒
7、和戊型肝炎病毒等戊型肝炎病毒等19731973年以来认识的病原体示例年以来认识的病原体示例年份年份微生物微生物疾病疾病19731973轮状病毒轮状病毒全球性婴儿腹泻的主要原因全球性婴儿腹泻的主要原因19761976小隐孢子虫小隐孢子虫急性和慢性腹泻急性和慢性腹泻19771977埃博拉病毒埃博拉病毒埃博拉出血热埃博拉出血热19771977嗜肺性军团杆菌嗜肺性军团杆菌军团病军团病1977Hantaan1977Hantaan病毒病毒伴有肾综合征的出血热伴有肾综合征的出血热19771977空肠弯曲菌空肠弯曲菌全球散布的肠病全球散布的肠病1980HTLV-IT1980HTLV-IT细胞淋巴瘤白血病细胞淋
8、巴瘤白血病19811981金葡萄菌产毒素株金葡萄菌产毒素株中毒性休克综合征中毒性休克综合征19821982大肠杆菌大肠杆菌O157O157：H7H7出血性肠炎、溶血性尿毒症出血性肠炎、溶血性尿毒症1982HTLV-II1982HTLV-II毛细胞白血病毛细胞白血病1982Burgdorferi1982Burgdorferi螺旋体螺旋体莱姆病莱姆病1983HIV1983HIV爱滋病爱滋病19831983幽门螺旋杆菌幽门螺旋杆菌消化性溃疡病消化性溃疡病1988HEV1988HEV肠道传播的非肠道传播的非A A、非、非B B型肝炎型肝炎1990Guanarito1990Guanarito病毒病毒委内
9、瑞拉出血热委内瑞拉出血热19921992霍乱弧菌霍乱弧菌O139O139与流行性霍乱有关的新株与流行性霍乱有关的新株1992Hellem1992Hellem巴尔通氏体巴尔通氏体猫抓病，杆状血管瘤病猫抓病，杆状血管瘤病1994Sabia1994Sabia病毒病毒巴西出血热巴西出血热1995G1995G型肝炎病毒（型肝炎病毒（HGVHGV）非肠道传播的非非肠道传播的非A A、非、非B B型肝炎型肝炎19951995人类疱疹病毒人类疱疹病毒8 8型型与爱滋病有关的与爱滋病有关的KaposiKaposi肉瘤肉瘤1996TSE1996TSE致病因子致病因子克罗伊茨非尔特克罗伊茨非尔特- -雅各布病的新变
10、型雅各布病的新变型19971997禽流感病毒禽流感病毒A A（H5N1H5N1）流感流感汤飞凡发现沙眼衣原体汤飞凡发现沙眼衣原体 病原微生物的致病机制方面病原微生物的致病机制方面微生物基因组研究方面微生物基因组研究方面微生物检测技术方面微生物检测技术方面 防治病原微生物措施方面防治病原微生物措施方面感染性疾病与人类感染性疾病与人类人类已经宣布消灭的疾病：天花在某些地区已经得到控制的疾病：麻疹、脊髓灰质炎、白喉、百日咳、结核、鼠疫正在流行的疾病：伤寒、痢疾、病毒性肝炎、霍乱感染性疾病与人类感染性疾病与人类新发生的传染性疾病新发生的传染性疾病原有微生物的再发原有微生物的再发一、新发生的传染性疾病一
11、、新发生的传染性疾病1、原已存在但未被认为是传染病原已存在但未被认为是传染病例如，消化性溃疡例如，消化性溃疡 ,T,T细胞白血病细胞白血病2、可能早已存在但未知可能早已存在但未知,技术进步发现或技术进步发现或人畜接触机会增加人畜接触机会增加例如，丙型肝炎例如，丙型肝炎, ,莱姆病莱姆病3、过去确实不存在过去确实不存在,由于微生物发生变异而产生由于微生物发生变异而产生例如，例如， AIDS, O139 ,AIDS, O139 ,耐药菌株耐药菌株, ,禽流感禽流感,SARS,SARS新发生的传染性疾病的原因新发生的传染性疾病的原因u人类的不良行为人类的不良行为进入以前未进入的原始森林和地区进入以前
12、未进入的原始森林和地区采矿采矿 旅游旅游 开垦开垦 嗜食野生动物嗜食野生动物 宠物热宠物热性乱和吸毒性乱和吸毒u气候气候u都市化都市化人口迁移人口迁移 拥挤拥挤 易感人群增加易感人群增加“贫民区贫民区” ”u医源性感染和滥用抗生素医源性感染和滥用抗生素u战争战争 贸易贸易 水土流失水土流失u微生物的持续不断变异微生物的持续不断变异新近认识的致病微生物新近认识的致病微生物禽流感病毒、禽流感病毒、SARSSARS、H1N1H1N1、产、产NDM-1NDM-1细菌细菌产产NDM-1NDM-1细菌细菌超级细菌超级细菌?产NDM-1细菌产NDM-1细菌：全称“产型新德里金属-内酰胺酶（New Delhi
13、 Metallo-lactamase 1, NDM-1）肠杆菌科细菌”，简称“产NDM-1细菌”，是一种对多种抗菌药物广泛耐药的细菌，主要为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌；特点：属于肠杆菌科细菌，致病力与普通肠杆菌科细菌没有差别；由于产生NDM-1导致广泛耐药，为“泛耐药菌”；主要导致医院感染；源于南亚地区，已在全球播散。 细菌耐药概念多重耐药（multiple drug resistance, MRD）: 指细菌同时对三种以上结构不同（作用机制不同）抗菌药物耐药，如头孢菌素、喹诺酮类、氨基糖苷类；泛耐药（pan-drug resistance, PDR）:细菌对本身敏感的所有药物耐药；超级细菌（s
14、uperbug）:并非科学概念，一般指PDR与部分MDR，没有确切定义，以下细菌属于此列：MRSA/VRSA;VRE;MDR-PA,PDR-AB;ESBL(+)+AmpC(+) 肠杆菌产碳青霉烯酶肠杆菌（包括产NDM-1细菌）细菌耐药的危害Cosgrove, et al.Clinical Infectious Diseases 2006; 42:S829结果耐药菌感染(33例)敏感菌感染（66例）RR(95%CI)P 值 病死率（%）159-住院时间（天）1171.73（1.14-2.65）0.01矫正住院时间（天）1171.23(0.81-1.87)0.34医疗费用（$）6659022231
15、1.710.04产与不产产与不产ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染的后果比较大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染的后果比较细菌耐药的危害项目 耐药组 对照组感染结局：% 治愈33.345.4 恶化9.1 4.0病死率%11.7 5.4抗生素使用种数 3.4/3 2.2/2抗生素药费合计(元)均数/中位数5485.87143.3/2820.51849.03278.9/802.5总费用合计（元）均数/中位数74511.7121406.8 /29052.519852.938268.4 /7445.5住院时间（天）33.939.2/21.018.123.7/12.0感染治疗时间（天）22.121.1/15.
16、011.912.5/9.0肖永红 等，抗生素类药物滥用公共问题研究，2008为什么需要关注产NDM-1细菌泛耐药导致的治疗挑战；多种肠杆菌科细菌发现；快速从南亚地区传播到欧美国家；不仅在医院感染这种发现，同时社区感染这种发现。产NDM-1细菌的发现2008年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌，该菌对所有-内酰胺类抗菌药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对多粘菌素E敏感；该患者有多年糖尿病和中风史，经常往返于印度和瑞典之间，此前4月曾因臀部脓肿在印度住院治疗，其后回到瑞典，因尿路感染再度入院；这株细菌携带一种新型金属-内酰胺酶，研究人员根据患者感染地命名这种酶为NDM-1。
17、 南亚和英国流行情况 Published online August 11, 2010 DOI:10.1016/S1473-3099(10)70143-2产NDM-1细菌种类肠杆菌科埃希菌属大肠埃希菌枸橼酸菌属弗劳地枸橼酸菌、异型枸橼酸菌、无丙二酸枸橼酸菌克雷伯菌属肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌肠杆菌属阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、板崎肠杆菌、聚团肠杆菌摩根菌属摩根摩根菌泛菌属成团泛菌、弥散泛菌普罗威登菌属产碱普罗威登菌、斯氏普罗威登菌、鲁氏普罗威登菌沙雷菌属粘质沙雷菌、液化沙雷菌、深红沙雷菌、居泉沙雷菌变形杆菌属奇异变形杆菌、普通变形杆菌、产粘变形杆菌志贺菌属志贺、宋内、弗氏、鲍氏志贺菌
18、沙门菌属伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、猪霍乱沙门菌、副伤寒沙门菌哈弗尼亚属蜂房哈弗尼亚菌耶尔森菌属鼠疫耶尔森菌，小肠结炎肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌传播方式医院内感染污染的医疗器械;污染的医疗用品;污染的手跨国传播跨国医疗旅游产NDM-1细菌感染临床特点产NDM-1细菌主要表现为多重耐药，致病力与敏感细菌没有差别；主要引起医院感染；有社区感染报道；感染危险因素：危重患者，入住ICU；长期住院患者；使用广谱抗菌药物，或长期应用抗菌药物；插管或侵袭性操作；免疫抑制；呼吸机应用;产NDM-1细菌感染临床特点主要感染类型：泌尿道感染；伤口感染；医院肺炎；呼吸机相关肺炎；血流感染；导管相关感染； 感染表现没有特
19、别之处。碳青霉烯治疗感染无效，提示该类细菌感染可能，需要及时进行检查。实验室诊断产NDM-1细菌感染临床表现与敏感菌没有差异，临床诊断困难；对碳青霉烯治疗无效的阴性菌感染需要考虑这类细菌感染可能；诊断主要依据实验室检查结果；实验室检查分为三步： 表型筛查表型筛查- -表型确认表型确认- -基因确证基因确证1.加强对产NDM-1细菌监测医院重视临床微生物检验，提高细菌耐药监测能力；临床参考细菌检验结果应用抗菌药物；定期公布各医院细菌耐药监测结果；定期回顾细菌耐药流行趋势，及时发现异常耐药现象，早期发现产NDM-1细菌加以控制。2.加强抗菌药物合理使用监管医疗机构应当有专门抗菌药物合理使用管理小组
20、，开展教育、培训、监督、检查抗菌药物使用情况；严格执行相关管理规定，特别是抗菌药物分类管理规定。特殊使用抗菌药物卫生部卫办医政发(2009)38号第四代头孢菌素：头孢吡肟、头孢匹罗、头孢噻利等；碳青霉烯类抗菌药物：亚胺培南/西司他丁、美罗培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南等；多肽类与其他抗菌药物：万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺等；抗真菌药物：卡泊芬净，米卡芬净，伊曲康唑（口服液、注射剂），伏立康唑（口服剂、注射剂），两性霉素B含脂制剂等。3.加强医院感染的预防与控制加强医务人员感染控制教育、培训，强化对NDM-1细菌等多重耐药菌感染的预防、控制的认识。在进行各种侵袭性操作中，严格执
21、行无菌操作。 严格执行医务人员手卫生规范：医疗机构必须提供充足的手卫生设施。医务人员在接触病人前后、进行侵入性操作前、接触病人使用的物品或处理其分泌物、排泄物后，必须洗手或用含醇类速干手消毒剂擦手。 3.加强医院感染的预防与控制3.加强医院感染的预防与控制加强对重点部门尤其是ICU物体表面的清洁、消毒 。消毒剂：含氯消毒剂、0.5%过氧乙酸、2%戊二醛、0.5%醋酸环己啶-乙醇等；表面消毒方法：选择不同消毒液擦拭或浸泡。3.加强医院感染的预防与控制隔离疑似或确诊产NDM-1细菌感染或定植者，预防耐药菌传播。采用接触隔离，将病人安置单独房间，接触患者时需要穿隔离衣、戴手套，相关医疗器械或物品如听
22、诊器、血压计等专用，不能专用的物品，需用后严格消毒。隔离期间需要定期检测耐药菌情况。 二、原有微生物的再发二、原有微生物的再发病毒性疾病病毒性疾病 狂犬病、登革热、黄热病狂犬病、登革热、黄热病寄生虫寄生虫 疟疾、血吸虫病、神经囊尾幼病、棘阿米巴病、内脏疟疾、血吸虫病、神经囊尾幼病、棘阿米巴病、内脏利氏曼病、弓形虫病、贾第虫病利氏曼病、弓形虫病、贾第虫病 、棘球幼病、棘球幼病细菌性细菌性 A A群链球菌、战壕热、鼠疫、白喉群链球菌、战壕热、鼠疫、白喉 、结核、百日咳、结核、百日咳、沙门菌属、肺炎球菌、霍乱沙门菌属、肺炎球菌、霍乱、多重耐药菌株的流行多重耐药菌株的流行多重耐药菌株的流行多重耐药菌株
23、的流行u葡萄球菌葡萄球菌u肠球菌肠球菌u肺炎链球菌肺炎链球菌u肠杆菌科肠杆菌科u结核分支杆菌结核分支杆菌多重耐药的结核杆菌多重耐药的结核杆菌是指病人排出的是指病人排出的TBTB至少已对至少已对INHINH和和RFPRFP产生耐药或对产生耐药或对5 5种基本抗痨药物（种基本抗痨药物（INHINH、RFPRFP、链霉素、乙胺丁醇、砒、链霉素、乙胺丁醇、砒嗪酰胺）中的两种以上（包括两种）耐药者嗪酰胺）中的两种以上（包括两种）耐药者发生原因：单一化疗、不合理化疗、不规律化疗发生原因：单一化疗、不合理化疗、不规律化疗对策：对策：合理化疗，预防合理化疗，预防MTBMTB出现出现加强检测，及时检出加强检测，
24、及时检出MTBMTB约有约有75%75%的临床分离株存在的临床分离株存在RNARNA聚合酶聚合酶亚单位基因亚单位基因(rpoB)(rpoB)发生突变，对发生突变，对RFPRFP耐药耐药肠杆菌科肠杆菌科肠杆菌科肠杆菌科对对三代头孢菌素耐药的肠杆菌科在临三代头孢菌素耐药的肠杆菌科在临床大量出现床大量出现主要耐药机制主要耐药机制: :产生超广谱产生超广谱-内酰胺酶内酰胺酶( (Extend-Extend-spectrum -Lactamases,ESBLs)spectrum -Lactamases,ESBLs)持续产持续产型型-内酰胺酶内酰胺酶肠球菌肠球菌肠球菌肠球菌可引起多种临床感染对头孢菌素、林
25、可霉素、磺胺类呈现天然耐药,对氨基糖甙类部分天然耐药现已出现耐万古霉素的肠球菌(VRE)耐万古霉素的肠球菌耐万古霉素的肠球菌(VRE)(VRE)由由VanA,VanBVanA,VanB和和VanCVanC控制控制VanAVanA对万古霉素和替考拉宁高度耐药对万古霉素和替考拉宁高度耐药VanBVanB对万古霉素高度耐药对万古霉素高度耐药, ,对替考拉宁敏感对替考拉宁敏感VanCVanC对万古霉素和替考拉宁高度耐药对万古霉素和替考拉宁高度耐药选用氯霉素红霉素四环素及利福平或其它选用氯霉素红霉素四环素及利福平或其它药物药物葡萄球菌葡萄球菌对甲氧西林耐药的葡萄球菌对甲氧西林耐药的葡萄球菌对万古霉素中度
26、敏感的葡萄球菌对万古霉素中度敏感的葡萄球菌对万古霉素耐药的葡萄球菌对万古霉素耐药的葡萄球菌对甲氧西林耐药的葡萄球菌对甲氧西林耐药的葡萄球菌由由mecAmecA基因编码的基因编码的PBP2aPBP2a与现有的与现有的-内酰胺类抗生素亲和力极低内酰胺类抗生素亲和力极低常伴有大内环酯类、林可霉素类和其常伴有大内环酯类、林可霉素类和其它抗生素的多重耐药它抗生素的多重耐药常呈异质性表达常呈异质性表达万古霉素是唯一有确切疗效的药物万古霉素是唯一有确切疗效的药物凝固酶阳性和阴性的葡萄球菌均有较凝固酶阳性和阴性的葡萄球菌均有较高的发生率高的发生率MRSAMRSA的调控机制的调控机制调控基因调控基因 mecI,
27、mecRImecI,mecRIMecIMecI为阻遏基因，其编码产物为为阻遏基因，其编码产物为mecImecI蛋蛋白，为白，为mecAmecA基因的抑制子（基因的抑制子（repressor)repressor)MecRIMecRI为诱导剂激活基因，在诱导剂存为诱导剂激活基因，在诱导剂存在时编码在时编码mecRImecRI蛋白，是一种辅助诱导因蛋白，是一种辅助诱导因子（子（co-inducer),co-inducer),解除对解除对mecImecI蛋白对蛋白对mecmecA A基因的抑制基因的抑制对万古霉素中度敏感的对万古霉素中度敏感的葡萄球菌（葡萄球菌（VISAorGISA)VISAorGIS
28、A)u对万古霉素的对万古霉素的MICMIC在在8-16ug/ml8-16ug/mlu已有数起报道、主要发生在已有数起报道、主要发生在MRSMRS中中u测定困难：异源性表达、生长缓慢、测定困难：异源性表达、生长缓慢、常规方法不能识别（常规方法不能识别（K-BK-B法、法、MicroScanMicroScanrapidplate)rapidplate)uVitekVitek 旧版软件不能测定（只能测到旧版软件不能测定（只能测到4ug/ml4ug/ml万古霉素），新版能测定万古霉素），新版能测定三、自动化技术在微生物学三、自动化技术在微生物学检验中的应用检验中的应用数码及数值鉴定技术数码及数值鉴定技
29、术常见的鉴定系统常见的鉴定系统 常见的鉴定系统常见的鉴定系统VITEKAMSVITEKAMS系统系统 icroScanicroScan系统系统BDBDBDPhoenixSystemBDPhoenixSystemBBL Crystal 半自动细菌鉴定系统半自动细菌鉴定系统BBL Crystal AutoReader自动细菌鉴自动细菌鉴定系统定系统 使用自动化鉴定仪的局限性使用自动化鉴定仪的局限性所有实验室工作人员必须认识仪器的局限性。所有实验室工作人员必须认识仪器的局限性。细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，及时补充和修改数据库是自动化
30、鉴而不断演变，及时补充和修改数据库是自动化鉴定仪生存的根本定仪生存的根本要加强对自动化仪器的日常维护和质控要加强对自动化仪器的日常维护和质控 自动化鉴定仪得出的结果，必须要与其它已获得自动化鉴定仪得出的结果，必须要与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。四、分子生物学在微生物检验应用四、分子生物学在微生物检验应用核酸杂交核酸杂交( (生物芯片）生物芯片）核酸扩增技术核酸扩增技术 靶扩增系统，包括靶扩增系统，包括PCRPCR、TMATMA、SDASDA；探针扩增
31、系统，包括探针扩增系统，包括QbetaQbeta复制酶、复制酶、LCRLCR；标记扩增技术。标记扩增技术。多重多重PCRPCR，RT-PCRRT-PCR，nest-PCRnest-PCR，RAPD,RAPD,PCR-SSCPPCR-SSCP等技术等技术- -细菌鉴定及分类细菌鉴定及分类分子生物学分子生物学- -耐药性检测耐药性检测耐药基因的检测耐药基因的检测糖肽类：糖肽类：vanAvanA，vanBvanB，vanBvanB2 2,vanC,vanC1 1，vanCvanC3 3，vanDvanD。-内酰胺类：内酰胺类：mecAmecA，blablaTEMTEM，blablaROB-1ROB-
32、1，blablaSHVSHV，blablaIMPIMP，blablaMIR-1MIR-1，blablaOXAOXA，blablaPER-1PER-1，blablaPER-2PER-2，blablaOXY-1OXY-1，blablaOXA-10/11OXA-10/11喹诺酮类：喹诺酮类：gyrAgyrA，gyrBgyrB，parEparE 乙胺丁醇：乙胺丁醇：embBembB，吡嗪酰胺，吡嗪酰胺pncApncA。利福平。利福平rpoBrpoB。链霉素：链霉素：rpsLrpsL，rrsrrs。异烟肼：异烟肼：katGkatG，inhAinhA，ahpCahpC应用基因技术进行分型和鉴定应用基因技术
33、进行分型和鉴定菌种鉴定菌种鉴定菌种鉴定菌种鉴定菌株分型菌株分型菌株分型菌株分型研究其亲缘关系：复发和研究其亲缘关系：复发和研究其亲缘关系：复发和研究其亲缘关系：复发和再感染判断再感染判断再感染判断再感染判断分析不同种属间的差别分析不同种属间的差别分析不同种属间的差别分析不同种属间的差别揭示种内不同菌株间的细揭示种内不同菌株间的细揭示种内不同菌株间的细揭示种内不同菌株间的细微差异微差异微差异微差异弥补了表型分型的不足弥补了表型分型的不足弥补了表型分型的不足弥补了表型分型的不足多用于分子流行病学研究多用于分子流行病学研究多用于分子流行病学研究多用于分子流行病学研究这些技术包括：这些技术包括：这些技
34、术包括：这些技术包括：RAPDRAPDRFLPRFLPAFLPAFLPSSCPSSCPPFGEPFGEDNA SequenceDNA Sequence细菌种属的鉴定DNADNA碱基组成的测定碱基组成的测定DNA-DNADNA-DNA杂交杂交16S 16S rRNArRNA同源性分析同源性分析 细菌种属特异基因细菌种属特异基因细菌毒力基因细菌毒力基因DNA碱基组成的测定细菌间细菌间DNADNA分子同源程度可以用细菌分子同源程度可以用细菌DNADNA分子分子的的G+CG+C或或A+TA+T摩尔百分比来反映。亲源关系越摩尔百分比来反映。亲源关系越近的细菌，近的细菌，G+C mol%G+C mol%越
35、相近越相近G+C mol%G+C mol%含量不同的细菌，为不同种细菌含量不同的细菌，为不同种细菌含量相同的可能为不同种的细菌含量相同的可能为不同种的细菌不同菌属间不同菌属间G+C mol%G+C mol%范围在范围在25%-75%25%-75%之间。之间。细菌的细菌的G+C mol%G+C mol%相当稳定，不受培养条件、相当稳定，不受培养条件、菌龄和其他外界因素影响。菌龄和其他外界因素影响。最常用的方法是热变性法，其次是高效液相最常用的方法是热变性法，其次是高效液相色谱法和浮力密度法色谱法和浮力密度法DNA-DNA杂交DNADNA杂交可得出杂交可得出DNADNA之间核苷酸顺序的互补程之间核
36、苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。目前最常用的是复性速率法目前最常用的是复性速率法同一菌的复性率为同一菌的复性率为100%100%80%-90%80%-90%的同源为同一种内同一亚种的细菌的同源为同一种内同一亚种的细菌60%-70%60%-70%同源性为同一种内不同亚种的细菌同源性为同一种内不同亚种的细菌20%-60%20%-60%同源则是同一属中的不同菌种同源则是同一属中的不同菌种这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可修正
37、其他方法的分类和鉴定错误修正其他方法的分类和鉴定错误16SrRNA16SrRNA同源性分析同源性分析rRNA-DNArRNA-DNA杂交杂交变性变性rRNArRNA与变性与变性DNADNA混合时，混合时，rRNArRNA与其互补与其互补的的DNADNA链形成杂交双链，链形成杂交双链，rRNArRNA分子与异源分子与异源DNADNA杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是硝酸纤维膜结合法硝酸纤维膜结
38、合法16SrRNA16SrRNA序列测定序列测定rRNArRNA分子具有高度保守性，在所有的细胞生物分子具有高度保守性，在所有的细胞生物中都存在，在长期的进化中，中都存在，在长期的进化中，16SrRNA16SrRNA的总碱的总碱基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互对齐进行比较相互对齐进行比较16S-23SrRNA16S-23SrRNA序列测定序列测定 在在16S16S和和23SrRNA23SrRNA的间隔区，各菌种的长度是的间隔区，各菌种的长度是不一样的，利用包含不一样的，利用包含16S16S和和23SrRNA23SrRNA部分序列部分序列的引物
39、对间隔区进行扩增，分析其长度多态，的引物对间隔区进行扩增，分析其长度多态，或结合或结合RFLPRFLP技术进行分析来鉴定菌种技术进行分析来鉴定菌种此外限制性内切酶长度多态性分析（此外限制性内切酶长度多态性分析（RFLPRFLP）、）、脉冲场凝胶电泳（脉冲场凝胶电泳（PFGEPFGE）、随机引物扩增法）、随机引物扩增法（RAPDRAPD）等技术常用于菌株间的差异比较）等技术常用于菌株间的差异比较 细菌种属特异基因细菌种属特异基因某些基因为细菌种特有或属共有，通过对这某些基因为细菌种特有或属共有，通过对这某些基因为细菌种特有或属共有，通过对这某些基因为细菌种特有或属共有，通过对这些基因的检测可以鉴
40、定细菌的种或属些基因的检测可以鉴定细菌的种或属些基因的检测可以鉴定细菌的种或属些基因的检测可以鉴定细菌的种或属如编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的如编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的如编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的如编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的invinvinvinv基因：基因：基因：基因：invAinvAinvAinvA、invBinvBinvBinvB、invCinvCinvCinvC、invDinvDinvDinvD、invEinvEinvEinvE等是等是等是等是一组只存在于致病性沙门菌中的独特的保守一组只存在于致病性沙门菌中的独特的保守一组只存在于致病性沙门菌中的独特的保守一组只存
41、在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列。鞭毛蛋白基因序列。鞭毛蛋白基因序列。鞭毛蛋白基因序列。鞭毛蛋白dlhdlhdlhdlh基因通常只存在于基因通常只存在于基因通常只存在于基因通常只存在于伤寒沙门菌伤寒沙门菌伤寒沙门菌伤寒沙门菌IS6110IS6110IS6110IS6110、IS986IS986IS986IS986插入片段为结核分枝杆菌复插入片段为结核分枝杆菌复插入片段为结核分枝杆菌复插入片段为结核分枝杆菌复合群所拥有等合群所拥有等合群所拥有等合群所拥有等细菌毒力基因细菌毒力基因某些以毒素致病的细菌含有特定的毒某些以毒素致病的细菌含有特定的毒力基因力基因霍乱弧菌的霍乱毒素基因霍乱弧菌的霍乱
42、毒素基因霍乱弧菌的霍乱毒素基因霍乱弧菌的霍乱毒素基因产肠毒素大肠埃希菌的耐热（产肠毒素大肠埃希菌的耐热（产肠毒素大肠埃希菌的耐热（产肠毒素大肠埃希菌的耐热（STSTSTST）和不）和不）和不）和不耐热肠毒素（耐热肠毒素（耐热肠毒素（耐热肠毒素（LTLTLTLT）白喉棒状杆菌的外毒素基因白喉棒状杆菌的外毒素基因白喉棒状杆菌的外毒素基因白喉棒状杆菌的外毒素基因可以应用以上技术测定毒力基因的存可以应用以上技术测定毒力基因的存在，以示相应的细菌存在在，以示相应的细菌存在 五、病毒变异的临床意义五、病毒变异的临床意义病毒突变体的起源病毒突变体的起源某些病毒的基因突变率可高达某些病毒的基因突变率可高达10
43、10-3-31010-4-4（例如逆转录病毒（例如逆转录病毒HIVHIV），），而有些病毒突变率仅为而有些病毒突变率仅为1010-8-81010-11-11（如疱疹病毒），相当于细胞（如疱疹病毒），相当于细胞DNADNA的自发突变率。大多数的自发突变率。大多数RNARNA病毒的突变率要远远高于病毒的突变率要远远高于DNADNA病毒病毒诱发突变诱发突变突变具有双重作用，病毒突变可使其抗原性发生改变突变具有双重作用，病毒突变可使其抗原性发生改变, ,从而逃逸从而逃逸免疫应答，但大多数突变是有害的，并会产生许多缺陷颗粒免疫应答，但大多数突变是有害的，并会产生许多缺陷颗粒人工突变人工突变现代分子生物学
44、技术可以对病毒基因组进行突变，如直接诱发寡现代分子生物学技术可以对病毒基因组进行突变，如直接诱发寡核苷酸突变和基于核苷酸突变和基于PCRPCR的基因突变技术已得到广泛应用。现在的基因突变技术已得到广泛应用。现在结合酶消化技术（引起基因缺失）和接头扫描技术（形成基因插结合酶消化技术（引起基因缺失）和接头扫描技术（形成基因插入），可以在病毒基因组的任何特异性位点，准确安全地诱导出入），可以在病毒基因组的任何特异性位点，准确安全地诱导出几乎任何类型的突变。这类突变可成为人工突变。几乎任何类型的突变。这类突变可成为人工突变。病毒突变的类型病毒突变的类型生化标志物基因突变生化标志物基因突变：耐药基因突变
45、，导致病毒毒力改变的特异突变；耐药基因突变，导致病毒毒力改变的特异突变；形成多态性，使蛋白质和核酸电泳迁移率发生改变以及对灭活剂形成多态性，使蛋白质和核酸电泳迁移率发生改变以及对灭活剂的敏感性改变。的敏感性改变。缺失突变：缺失突变：在某些方面与无义突变相似，但可以是一个或在某些方面与无义突变相似，但可以是一个或多个病毒基因缺失，也可以是基因组中非编码调控区（如多个病毒基因缺失，也可以是基因组中非编码调控区（如启动子等）的缺失。启动子等）的缺失。自发缺失突变体通常可在病毒群体中累积，生成大量缺陷自发缺失突变体通常可在病毒群体中累积，生成大量缺陷- -干扰干扰（D.I.D.I.）颗粒。尽管这些颗粒
46、不具有感染性，但仍有一定的遗传学）颗粒。尽管这些颗粒不具有感染性，但仍有一定的遗传学上的意义，有人认为它们在某些病毒感染过程中以及发病机理方上的意义，有人认为它们在某些病毒感染过程中以及发病机理方面起着重要作用。通过重组，可以使基因缺失病毒回复突变为野面起着重要作用。通过重组，可以使基因缺失病毒回复突变为野生型病毒，但发生频率通常比较低。生型病毒，但发生频率通常比较低。 肝炎病毒的变异及基因分型概述肝炎病毒的变异及基因分型概述nHAVHAV为小为小RNARNA病毒科成员，现已被归入嗜肝病毒科成员，现已被归入嗜肝RNARNA病毒科。人源病毒科。人源HAVHAV存在存在4 4个基因型个基因型（型）
47、，型间核苷酸同源性型），型间核苷酸同源性85%,85%.85%.不同基因型的不同基因型的HAVHAV抗原性相同，因此，抗原性相同，因此，HAVHAV只有一个血清型只有一个血清型nHBVHBV为嗜肝为嗜肝DNADNA病毒科成员，可分为病毒科成员，可分为6 6个基个基因型因型（基因型（基因型AFAF）, ,不同地域、人种的不同地域、人种的HBVHBV基因型可能有着不同的分布。基因型的基因型可能有着不同的分布。基因型的差异与致病性、抗病毒治疗效果、预后等的差异与致病性、抗病毒治疗效果、预后等的关系尚无明确结论，尚待进一步研究关系尚无明确结论，尚待进一步研究肝炎病毒的变异及基因分型概述肝炎病毒的变异及
48、基因分型概述nHDVHDV是一种是一种RNARNA缺陷病毒现被归类于卫星病毒科成员。世界缺陷病毒现被归类于卫星病毒科成员。世界各地各地HDVHDV不同分离株的核苷酸变异在不同分离株的核苷酸变异在11%11%17%17%之间。之间。HDVHDV可分为可分为3 3个基因型个基因型 ，大部分分离株为，大部分分离株为 型，型， 型和型和型分别在日型分别在日本和南美多见。本和南美多见。n HCVHCV为黄病毒科成员，该病毒变异较大，目前至少存在为黄病毒科成员，该病毒变异较大，目前至少存在6 6个个以上的基因型以上的基因型。HCVHCV的基因型与致病、预后、干扰素的治疗的基因型与致病、预后、干扰素的治疗等
49、密切相关，需引起高度重视。等密切相关，需引起高度重视。n HEVHEV为环状病毒科成员，感染后导致急性肝炎，临床表现和为环状病毒科成员，感染后导致急性肝炎，临床表现和发病经过与甲型肝炎有一定差异，比如妊娠妇女感染的死亡发病经过与甲型肝炎有一定差异，比如妊娠妇女感染的死亡率较高；发病者年龄分布不明显；更容易发生瘀胆；重型肝率较高；发病者年龄分布不明显；更容易发生瘀胆；重型肝炎的发生率高于甲肝；患病后无终身免疫等等。世界各地的炎的发生率高于甲肝；患病后无终身免疫等等。世界各地的HEVHEV分离株可分为分离株可分为2 2个基因型个基因型，即缅甸型和墨西哥型，我国、，即缅甸型和墨西哥型，我国、东南亚各
50、国及印度流行的为缅甸型。东南亚各国及印度流行的为缅甸型。HBV-HBV-生物学特性生物学特性不完全闭合环状双链不完全闭合环状双链DNADNAS S、C C、P P和和X4X4个个ORFsORFsS S基因基因C C基因基因P P基因基因X X基因基因S S基因区变异基因区变异 S S基因区包括前基因区包括前S1S1、前、前S2S2及及S S基因，分别编码前基因，分别编码前S1S1蛋白、前蛋白、前S2S2蛋白及主蛋白蛋白及主蛋白前前S1S1蛋白能调节蛋白能调节HBsAgHBsAg的分泌；它的第的分泌；它的第212147aa47aa是是HBVHBV与靶与靶细胞上特异受体结合的主要部位，但第细胞上特
51、异受体结合的主要部位，但第3 377aa77aa均参与均参与HBVHBV感感染靶细胞的过程染靶细胞的过程前前S2S2蛋白蛋白N N末端的末端的5 5个个aaaa是自被感染细胞内分泌完整病毒颗粒所是自被感染细胞内分泌完整病毒颗粒所必需的。必需的。前前S1S1起始码下游第起始码下游第230230碱基，可突变形成终止码，并碱基，可突变形成终止码，并影响前影响前S2S2起始码，这种突变与起始码，这种突变与HBVHBV逃避干扰素治疗和宿主免疫逃避干扰素治疗和宿主免疫清除有关清除有关HBVDNAHBVDNA第第2995-3177nt2995-3177nt位于前位于前S S开放读码框开放读码框(ORF)(O
52、RF)内，但其内，但其缺缺失可削弱前失可削弱前S S的免疫性的免疫性，但仍能保留与肝细胞的结合位点，但仍能保留与肝细胞的结合位点，有利有利于于HBVHBV逃避机体的免疫攻击，形成慢性携带状态逃避机体的免疫攻击，形成慢性携带状态。S S基因区变异基因区变异HBsAgHBsAg第第99-169aa99-169aa是诱导中和抗体产生的决是诱导中和抗体产生的决定簇定簇。124-137aa124-137aa和和138-l47aa138-l47aa，特别是第，特别是第142142，l44l44，145aa145aa三处突变，包括典型的三处突变，包括典型的“ “疫苗疫苗逃避株逃避株” ”145145甘氨酸甘
53、氨酸精氨酸。精氨酸。这些突变可削这些突变可削弱或改变弱或改变HBsAgHBsAg的免疫原性，降低的免疫原性，降低HBsAgHBsAg被被HBIGHBIG识别的能力；识别的能力；这些突变可能是长期免疫压力筛选的结果。这些突变可能是长期免疫压力筛选的结果。P P基因区变异基因区变异 P P基因区编码基因区编码HBVDNAHBVDNA聚合酶聚合酶(DNAP)(DNAP)，其自然突变率与，其自然突变率与逆转录病毒逆转录病毒gaggag基因相近，每年约为基因相近，每年约为210210-4-4碱基位点碱基位点抗抗HBVHBV药物胞苷类似物拉咪呋啶药物胞苷类似物拉咪呋啶(1amivudine)(1amivu
54、dine)和鸟苷类似和鸟苷类似物泛昔洛韦物泛昔洛韦(famciclovir)(famciclovir)，主要作用于，主要作用于DNAPDNAP，通过与底，通过与底物物dNTPdNTP竞争结合以抑制竞争结合以抑制HBVHBV的逆转录和复制的逆转录和复制HBVHBV耐药株的突变就发生在耐药株的突变就发生在DNAPDNAP基因内。基因内。DNAPDNAP催化中催化中心由心由“ “酪氨酰酪氨酰(Y)(Y)、蛋氨酰、蛋氨酰(M)(M)、天冬氨酰、天冬氨酰(D)”(D)”基序基序(YMDD(YMDDmotif)motif)组成，是组成，是DNAPDNAP发挥催化活性所必需的关键结构。针发挥催化活性所必需的
55、关键结构。针对核苷类药物的抗病毒治疗，病毒对核苷类药物的抗病毒治疗，病毒YMDDYMDD中中MM突变为异亮突变为异亮氨酸氨酸(I)(I)或缬氨酸或缬氨酸(V)(V)。发生突变以后可能使病情加剧（即所。发生突变以后可能使病情加剧（即所谓反跳），对所用药物产生耐受谓反跳），对所用药物产生耐受S S基因区和基因区和P P基因区变异的相互影响基因区变异的相互影响 由于由于S S基因区完全重叠于基因区完全重叠于P P基因区内，特别是基因区内，特别是HBsAgHBsAg决定簇区和决定簇区和DNAPDNAP致第致第454-524aa(454-524aa(系主系主要催化活性区要催化活性区) )相重叠，因此，与
56、拉咪夫丁等相重叠，因此，与拉咪夫丁等抗病毒药相关的抗病毒药相关的DNAPDNAP的突变至少可致的突变至少可致HBsAgHBsAg中中5 5处处aaaa改变改变DNAPDNAP的突变正好位于的突变正好位于HBsAgHBsAg决定簇区决定簇区( (主要主要亲水区亲水区) )，提示该处，提示该处P P基因的突变也可导致基因的突变也可导致“ “中中和逃避和逃避(neutralizationescape)”(neutralizationescape)”C C基因区的调控序列：基因区的调控序列：C C基因区中前基因区中前C C和和C C基因上游的调控序列基因上游的调控序列基本基本C C区启动子区启动子(b
57、asalcorepromoter(basalcorepromoter，BCP)BCP)可启动前可启动前CmRNACmRNA和和CmRNACmRNA的转录的转录核心上游调节序列核心上游调节序列(coreupstreamregulatory(coreupstreamregulatorysequcncesequcnce，CURS)CURS)能定向调节能定向调节BCPBCP的活性的活性负调节元件负调节元件(negativeregulatoryelement,NRE)(negativeregulatoryelement,NRE)，可抑制或消除，可抑制或消除CURSCURS的活性的活性C C基因区调控序列
58、的变异基因区调控序列的变异C C基因区调控序列均可发生变异，基因区调控序列均可发生变异，其中最重要和最常见的突变是其中最重要和最常见的突变是BCPBCP中的中的1762ntAT1762ntAT，l764ntGAl764ntGA，两者常同时出现，两者常同时出现，与活动性肝炎、肝硬变、肝癌、急性肝衰竭等相关，在后与活动性肝炎、肝硬变、肝癌、急性肝衰竭等相关，在后者又常合并者又常合并l653ntCTl653ntCT。体外试验显示这三处联合突变可明显减少前体外试验显示这三处联合突变可明显减少前CmRNACmRNA及及HBeAgHBeAg的产生。的产生。T1762A1764T1762A1764变异很少在
59、急性肝炎中检出，主要出现于慢变异很少在急性肝炎中检出，主要出现于慢性感染过程中，可能是宿主免疫筛选的结果。性感染过程中，可能是宿主免疫筛选的结果。T1762T1762突变亦多出现于突变亦多出现于HBeAgHBeAg抗抗HBeHBe血清学转换时，可血清学转换时，可作为判断作为判断HBeAg(+)HBeAg(+)免疫耐受者发生免疫激活的指标，以免疫耐受者发生免疫激活的指标，以及干扰素治疗时选择合适病例的一个依据。及干扰素治疗时选择合适病例的一个依据。 前前C C基因突变：基因突变：前前C C基因亦可发生多处位点突变，最有临床意义的突基因亦可发生多处位点突变，最有临床意义的突变是变是l896ntGA
60、l896ntGA，可使前，可使前C C区第区第2828密码子密码子TGG(TGG(色氨色氨酸酸) )转变为终止码转变为终止码TAGTAG，导致前导致前C C蛋白翻译中断，蛋白翻译中断，HBeAgHBeAg不能产生不能产生；前前C C起始码亦可发生突变而不能启动起始码亦可发生突变而不能启动HBeAgHBeAg合成，合成，此此突变有助于突变有助于HBVHBV逃避免疫攻击而形成慢性感染状态逃避免疫攻击而形成慢性感染状态，也见于干扰素治疗后，提示以也见于干扰素治疗后，提示以HBeAgHBeAg转阴作为疾病好转阴作为疾病好转的指标有时并不准确。转的指标有时并不准确。病毒复制受到干扰后，有可能提高病毒复制
61、受到干扰后，有可能提高HBVDNAHBVDNA整合入宿整合入宿主染色体的能力，从而致癌。主染色体的能力，从而致癌。前前C C突变先于抗突变先于抗HBe(+)HBe(+)出现者，可能是干扰素等药物出现者，可能是干扰素等药物诱导的转换，反之则可能是回复突变，因为在抗诱导的转换，反之则可能是回复突变，因为在抗HBeHBeAgHBeHBeAg逆转换者的血清中只测及逆转换者的血清中只测及HBVHBV野生株。野生株。CC基因突变：基因突变：C C基因可发生多位点多种类型的突变，是基因可发生多位点多种类型的突变，是HBVHBV感染慢性化、感染慢性化、肝细胞损伤加重的重要原因。肝细胞损伤加重的重要原因。有有3
62、 3个突变集中区域：个突变集中区域：第第48-60aa48-60aa；第；第84-10laa84-10laa，其中第，其中第87-87-97aa97aa更是一变异热点；第更是一变异热点；第l47-155aal47-155aa，此处系前体蛋白处理，此处系前体蛋白处理位点，相应的位点，相应的DNADNA序列发生错义突变或出现终止码将减少序列发生错义突变或出现终止码将减少病毒蛋白的产生和分泌。病毒蛋白的产生和分泌。CarianiCariani报道前报道前C C基因变异可同时合并前基因变异可同时合并前S S或或S S基因变异，不基因变异，不能同时合成能同时合成HBcAgHBcAg、前、前S S蛋白等免
63、疫原性蛋白，使蛋白等免疫原性蛋白，使HBVHBV更易更易逃避免疫清除。逃避免疫清除。C C区内部缺失突变区内部缺失突变(coreinternaldeletion(coreinternaldeletion，CID)CID)的的HBVHBV自然自然变异株，可见于所有无症状携带者、变异株，可见于所有无症状携带者、l4 l4100100的慢性乙的慢性乙型肝炎患者型肝炎患者( (香港地区检出率仅香港地区检出率仅7 7) )，以及肝细胞肝癌、肾，以及肝细胞肝癌、肾移植后使用免疫抑制剂者，但很少在急性肝炎患者中检出移植后使用免疫抑制剂者，但很少在急性肝炎患者中检出（五）（五）X X基因区变异基因区变异 HB
64、xAgHBxAg也可能成为致敏也可能成为致敏CTLCTL攻击的靶抗原。患者血攻击的靶抗原。患者血清中可溶性清中可溶性HBxAgHBxAg相关多肽可调节相关多肽可调节CTLCTL对靶细胞的对靶细胞的免疫识别，因此免疫识别，因此ORF-XORF-X变异可能亦不利于清除变异可能亦不利于清除HBVHBVHBxAgHBxAg是一种强力反式激活因子，可通过多种途径是一种强力反式激活因子，可通过多种途径促发肝细胞癌变促发肝细胞癌变丙型肝炎病毒变异的意义丙型肝炎病毒变异的意义HCVRNAHCVRNA的突变率是真核和原核的突变率是真核和原核DNADNA复制突变率复制突变率的的10106 6倍，达倍，达1010-
65、3-31010-4-4nt/nt/碱基位点碱基位点. .年。年。以点突变为主，偶可出现插入突变及缺失突变，但核以点突变为主，偶可出现插入突变及缺失突变，但核苷酸插入或缺失为苷酸插入或缺失为3 3的倍数。的倍数。在进化过程中，在进化过程中，5NCR5NCR和和C C最保守，最保守，NSNS其次，其次，E E最易最易变异，尤以变异，尤以E2E2NSlNSl基因基因NH2-NH2-末端的高变区末端的高变区(HVRl)(HVRl)为甚。为甚。HVRlHVRl变异有下述生物学意义。变异有下述生物学意义。免疫逃逸免疫逃逸慢性化慢性化基因分型基因分型SimmondsSimmonds等根据病毒基因组核苷酸序列
66、的同源性提出了一个等根据病毒基因组核苷酸序列的同源性提出了一个HCVHCV基因型分类命名系统基因型分类命名系统该系统将该系统将HCVHCV分为分为6 6个主要基因型。个主要基因型。每型又由若干亚型组成，不同基因型之间全基因组序列差每型又由若干亚型组成，不同基因型之间全基因组序列差异达异达3030以上或氨基酸差异达以上或氨基酸差异达25253030，同一基因型中，同一基因型中不同亚型之间全基因组序列差异达不同亚型之间全基因组序列差异达2020以上以上现在有全基因组序列资料的仅现在有全基因组序列资料的仅1a1a、1b1b、2a2a、2b2b和和3b3b等等5 5型，亚型，亚基因区序列比较也可取得可
67、信的相同结果，且更简便。基因区序列比较也可取得可信的相同结果，且更简便。目前已知的各基因型目前已知的各基因型E1E1、NS4NS4、NS5NS5基因序列资料可用于鉴定基因序列资料可用于鉴定HCVHCV新的基因型、亚型和无流行病学意义的分离株。迄今已发新的基因型、亚型和无流行病学意义的分离株。迄今已发现现HCVHCV的主要基因型有的主要基因型有1111个，亚型个，亚型7070余个。余个。HCVHCV基因型的地理分布特点基因型的地理分布特点 HCVHCV基因型分布存在明显的地理差异基因型分布存在明显的地理差异其中其中1a1a型在美国、巴西和欧洲西北部占优势，型在美国、巴西和欧洲西北部占优势，1b1
68、b型在远东、欧洲东西部多见，型在远东、欧洲东西部多见，2a2a和和2b2b型多分布于亚洲和欧洲，型多分布于亚洲和欧洲，3a3a型在西方一些国家以及泰国、新加坡多见，并在东印型在西方一些国家以及泰国、新加坡多见，并在东印度和孟加拉国的一些感染人群中的唯一基因型。度和孟加拉国的一些感染人群中的唯一基因型。其他少见基因型的分布则局限于某些持殊区域，如其他少见基因型的分布则局限于某些持殊区域，如4 4型在型在中东和中非占优势；中东和中非占优势；5a5a型局限于南非；型局限于南非；6a6a型主要见于香型主要见于香港、麦加和越南。港、麦加和越南。HCVHCV基因型的地理分布特点基因型的地理分布特点中国大陆
69、仅有中国大陆仅有1b1b和和2a2a两型，且以两型，且以1b1b型为主，在南方型为主，在南方城市城市( (南京、南宁、成都南京、南宁、成都) )，1b1b型占型占9090以上，北方城以上，北方城市市( (哈尔滨、沈阳、兰州哈尔滨、沈阳、兰州) )，2a2a型占型占46467070。大陆。大陆的的HCVHCV基因型多样性不如香港、台湾及日本，但混合基因型多样性不如香港、台湾及日本，但混合感染率明显高于其他国家和地区。感染率明显高于其他国家和地区。郭林生等采用郭林生等采用EnomotoEnomoto分型法在分型法在1010余省、市的余省、市的122122例例血清标本中发现血清标本中发现5 5个基因
70、型个基因型(RT(RT、K1K1、K2aK2a、K2bK2b、K3)K3)，其中，其中K1K1和和K2K2型占型占75.475.4。目前我国在。目前我国在HCVHCV基因基因分型中所用方法难以检出分型中所用方法难以检出6a6a或其他新基因型，因此不或其他新基因型，因此不能除外有其他基因型感染的可能。能除外有其他基因型感染的可能。迄今尚难对迄今尚难对HCVHCV基因型的地理分布作出解释基因型的地理分布作出解释。研究研究HCVHCV基因型的意义基因型的意义作为作为IFNIFN药效的预测指标药效的预测指标IFNIFN是目前首选的抗是目前首选的抗HCVHCV药，但反药，但反应率仅应率仅2525左右。左
71、右。基因型是基因型是IFNIFN药效的最重要预测指标药效的最重要预测指标K1K11b1b型和型和K2aK2a2a2a型的长期缓解率分别为型的长期缓解率分别为4040和和9191。1b1b型的效果低于型的效果低于1a1a、2a2a、2b2b和和3 3型者，型者，4 4、5 5、6 6型型HCVHCV对对IFNIFN治疗的反应性尚不清楚。治疗的反应性尚不清楚。在在IFNIFN治疗前应检测病人的治疗前应检测病人的HCVHCV基因型和血清病毒基因型和血清病毒量，并以此作为疗效预测指标。量，并以此作为疗效预测指标。IFNIFN治疗治疗2 2周后肝组织中负链周后肝组织中负链HCVRNAHCVRNA阴性也是
72、预阴性也是预测测IFNIFN长期疗效的有用指标。长期疗效的有用指标。1b1b型对型对IFNIFN治疗的低反应性原因尚不完全清楚，可治疗的低反应性原因尚不完全清楚，可能与能与1b1b型型HCVHCV的的E2E2NS1NS1糖蛋白高变区异质性程糖蛋白高变区异质性程度及病毒复制能力较强有关。度及病毒复制能力较强有关。 研究研究HCVHCV基因型的意义基因型的意义与肝损害程度的关系：与肝损害程度的关系：文献报道文献报道1b1b型型HCVHCV与重度慢性肝炎、肝硬化和与重度慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌肝细胞癌(HCC)(HCC)关系密切。关系密切。1b1b型者肝组织学分级、分期的恶化进展速度及型者肝组织学
73、分级、分期的恶化进展速度及血清平均血清平均HCVRNAHCVRNA效价均明显高于效价均明显高于2 2型；型；1b1b型较其他型引起更严重的肝损害；肝细胞癌型较其他型引起更严重的肝损害；肝细胞癌患者中患者中1b1b型阳性率明显高于慢性肝炎和肝硬化型阳性率明显高于慢性肝炎和肝硬化者。者。研究研究HCVHCV基因型的意义基因型的意义1b1b型型HCVHCV致病性较强的可能机制是：致病性较强的可能机制是： E E基因区另有一高变区，随时间推移其突基因区另有一高变区，随时间推移其突变率增加变率增加3 34 4培，使病毒有可能逃避宿培，使病毒有可能逃避宿主的免疫监视；主的免疫监视； 表达或编码的蛋白有表达
74、或编码的蛋白有较强的细胞毒作用。较强的细胞毒作用。多因素分析显示多因素分析显示1b1b型是肝癌发生最重要型是肝癌发生最重要的危险因子的危险因子也有不支持上述观点，需进一步研究包也有不支持上述观点，需进一步研究包括建立体内、体外括建立体内、体外HCVHCV复制和蛋白表达复制和蛋白表达模型等模型等研究研究HCVHCV基因型的意义基因型的意义HCVHCV感染的诊断：感染的诊断：HCVHCV各基因型的基因组核苷酸序各基因型的基因组核苷酸序列差异导致其表达的蛋白免疫原性和抗原性的区别，列差异导致其表达的蛋白免疫原性和抗原性的区别，抗原性变异，尤以非结构编码区蛋白如抗原性变异，尤以非结构编码区蛋白如C33
75、(NS3)C33(NS3)、C-100(NS4)C-100(NS4)、NS5(NS5a)NS5(NS5a)较大较大目前所使用的第目前所使用的第3 3代抗体几乎都来自代抗体几乎都来自1a1a型型HCVHCV的重组蛋白的重组蛋白抗原，感染抗原，感染1a1a型的献血者抗体血清效价是感染型的献血者抗体血清效价是感染2 2、3 3型者型者的的4.54.5倍，在非倍，在非1 1型感染为主的国家应用此抗体检测时应慎型感染为主的国家应用此抗体检测时应慎重解释检测结果。重解释检测结果。目前有学者采用不同基因型目前有学者采用不同基因型HCVHCV的重组蛋白建立的重组蛋白建立HCVHCV抗体检测方法，应根据本地抗体
76、检测方法，应根据本地HCVHCV基因型特点研基因型特点研制诊断试剂制诊断试剂研究研究HCVHCV基因型的意义基因型的意义 HCVHCV疫苗的制备：有效的疫苗是防治疫苗的制备：有效的疫苗是防治HCVHCV感染的重感染的重要手段。要手段。有效的有效的HCVHCV疫苗应包含各主要基因型的免疫原，疫苗应包含各主要基因型的免疫原，研制研制HCVHCV疫苗还有许多问题需要解决，最重要的是要明确疫苗还有许多问题需要解决，最重要的是要明确是诱导产生中和抗体为主，还是以激发细胞毒是诱导产生中和抗体为主，还是以激发细胞毒T T细胞活性细胞活性为主，为主，目前认为以目前认为以C C和和NS3NS3蛋白或多肽蛋白或多肽( (与高度保守的与高度保守的T T细胞位相细胞位相一致一致) )为基础的疫苗比为基础的疫苗比E E蛋白更能诱导广泛的交叉保护反应。蛋白更能诱导广泛的交叉保护反应。其他：其他：HCVHCV基因型研究对鉴定传染源和追踪传播途基因型研究对鉴定传染源和追踪传播途径也有重要意义径也有重要意义 复习题复习题目前临床常见的耐药问题有哪些？目前临床常见的耐药问题有哪些？用分子生物学的手段怎样鉴定细菌的用分子生物学的手段怎样鉴定细菌的种属？种属？研究研究HBVHBV和和HCVHCV基因分型和变异有哪基因分型和变异有哪些意义？些意义？使用自动化鉴定仪需注意哪些问题？使用自动化鉴定仪需注意哪些问题？
