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1、 类号 密 级 UDC 保密期限 博 士 学 位 论 文博 士 学 位 论 文 题 目 结核分枝杆菌ESX-1 分泌蛋白调控巨噬细胞功能的研究 作者姓名 屈 野 指导教师 陈薇 研究员 徐俊杰 研究员 培养单位 生物工程研究所 专业名称 微生物学 论文提交日期 2013 年 05 月 20 日 学位授予单位 中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 答辩委员会主席 中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 制中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 制 目 录目 录 缩略词表 - 1 中文摘要 - 5 英文摘要 - 9 前 言 - 13 第一部分 表达
2、结核分枝杆菌 ESAT-6 与 EspB 的小鼠巨噬细胞系的建立-19 第二部分 表达结核分枝杆菌 ESAT-6 与 EspB 的重组 BCG 的构建-33 第三部分 ESAT-6 调控巨噬细胞吞噬功能的研究-45 第四部分 ESAT-6 调控巨噬细胞凋亡的研究-63 第五部分 EspB 调控巨噬细胞吞噬体成熟的研究-75 讨 论 -87 结 论 -89 参考文献 -91 附 录 -95 综 述 -99 论 著 -105 个人简介 -113 致 谢 -115 主 要 缩 略 词 表主 要 缩 略 词 表 英文缩写英文缩写 英文全名英文全名 中文译名中文译名 A absorbance 吸光度 B
3、CG Bacille Calmette Guerin 卡介苗 bp base pair(s) 碱基对 Caspase-3 cysteine-containing aspartate-specific proteases 3 细胞凋亡蛋白酶 3 CFP-10 culture filtrate protein of 10 kDa 培养物滤过蛋白-10 DMEM Dulbecco modified Eagle medium 杜尔伯科改良伊格尔培养 基 dNTP deoxyribonucleotide triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 E.coli Escherichia coli 大肠杆
4、菌 EGFP enhanced green fluorescent protein 增强型绿色荧光蛋白 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 ERK 1/2 extracellular signal-regulated kinase1/2 细胞外信号调节激酶 1/2 ESAT-6 early secreted antigenic target-6 早期分泌抗原靶蛋白-6 EspB ESX-1 secretion-associated protein B ESX-1分泌相关蛋白B EspBN N terminal of EspB（50k
5、Da） EspB的N端（50kDa） ESX-1 ESAT-6 system 1 ESAT-6系统1 FITC fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 FCS Fetal Calf Serum 胎牛血清 HBSS Hanks balanced salt solution Hanks平衡盐溶液 h hour(s) 小时 His histidine 组氨酸 HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 1 主要缩略词表 - 2 - IFN- Interferon 干扰素 IL-12 Interleukin-12 白介素 12 IPTG isop
6、ropylthio-D-galactoside 异丙基硫代半乳糖苷 kDa kilodalton 千道尔顿 LB Luria-Bertain broth LB 培养基 LDH lactate dehydrogenase 乳酸脱氢酶 LPS lipopolysaccharide 脂多糖 MAPK mitogen-activated protein kinase 有丝分裂原活化蛋白激酶 MEM minimal essential medium 最低必需培养基 min minute(s) 分钟 mL millilitre 毫升 MOI Multiplicity of Infection 感染复数 M
7、.tb Mycobacteria tuberculosis 结核分枝杆菌 nM nanomole 纳摩尔 OD optical density 光密度 PAGE polyacrylamidegel electrophresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS/T phosphate-buffered saline/tween20 磷酸盐缓冲液/吐温20 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 pET21-ESAT-6 pET21a+ plasmid expressing ESAT-6 表达ESAT-6的pET21a+质 粒 pET21-EspB pET21a+
8、plasmid expressing EspB 表达EspB的pET21a+质粒 rBCG-E6 recombinant BCG expressing intracellular ESAT-6 细胞内表达ESAT-6的重组 BCG rBCG-SE6 recombinant BCG expressing secreted ESAT-6 分泌表达ESAT-6的重组 BCG 主要缩略词表 - 3 - rBCG-EB recombinant BCG expressing intracellular EspB 细胞内表达EspB的重组 BCG rBCG-EN recombinant BCG expres
9、sing secreted EspBN 分泌表达EspBN的重组 BCG RAW-flag-E6 RAW264.7 cell line expressing flag-ESAT-6 fusion protein 表达flag-ESAT-6融合蛋白 的RAW264.7细胞系 RAW-flag-EGFP RAW264.7 cell line expressing flag-EGFP fusion protein 表达flag-EGFP融合蛋白 的RAW264.7细胞系 RAW-flag- EspBN RAW264.7 cell line expressing flag-EspBN fusion p
10、rotein 表达flag-EspBN融合蛋白 的RAW264.7细胞系 RAW-E6 RAW264.7 cell line expressing EGFP-ESAT-6 fusion protein 表达EGFP-ESAT-6融合蛋 白的RAW264.7细胞系 RAW-EGFP RAW264.7 cell line expressing EGFP protein 表 达 EGFP 蛋 白 的 RAW264.7细胞系 RAW-EspB RAW264.7 cell line expressing EGFP-EspB fusion protein 表达EGFP-EspB融合蛋白 的RAW264.7
11、细胞系 RAW- EspBN RAW264.7 cell line expressing EGFP-EspBN fusion protein 表达EGFP-EspBN融合蛋 白的RAW264.7细胞系 RD-1 region of difference-1 差异区域-1 rpm round per minute 转/分钟 SDS sodium dodecylsulfate 十二烷基硫酸钠 sESAT-6 ESAT-6 gene with signal sequence 有信号序列ESAT-6基因 TAE Tris/acetate/EDTA buffer Tris/乙酸/EDTA缓冲液 TB t
12、uberculosis 结核 TBS/T Tris-Buffered Saline /Tween 20 Tris盐/ Tween 20缓冲液 TE Tris/EDTA buffer Tris/EDTA缓冲液 TLR2 Toll-like receptor 2 Toll样受体2 g microgramme 微克 L microliter 微升 主要缩略词表 - 4 - 中文摘要 - 5 - 结核分枝杆菌 ESX-1 分泌蛋白调控巨噬细胞功能的研究 近些年研究证实，ESX-1 蛋白分泌系统与结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活、生长繁 殖及致病密切相关，是结核分枝杆菌的一个重要毒力因子。现已确认，ESX-1 系统可分 泌多个结核分枝杆菌蛋白，这些分泌蛋白存在共分泌现象，缺失其中某种蛋白就会影响 其他蛋白的分泌，同时导致结核分枝杆菌毒力及致病性的显著下降，因此通过基因敲除 和过表达去单独
