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1、2 0 0 3 年1 0 月 广鹾师范大学学报( 自然科学版) J O U R N A LO FG U A N G X IN O R M A LU N I V E R S I T Y 化学合成胸腺肽d 。的分离与纯化工艺研究 韩香，顾军，苑庆兰，雷鹏森，甘一如 ( 武警医学院化学教研室，天津3 0 0 1 6 2 ) 胸腺肽q ( T a 。) 是酸性甚强的2 8 肽，分子量31 0 8 ，等电点4 2 ，N 端被乙酰化胸腺肽a 。f 临床用途广 泛，对H B V ，H I V ，恶性肿瘤及免疫缺陷“3 等疾病均有显著疗效，是一种针对T 细胞的免疫增强剂目前， 临床引进的胸腺肽“。制剂均为化学
2、合成产品化学合成的多肽粗品中，含有许多大小、性质与产品相近的 杂质，不易纯化本研究对F m o c 固相方法合成的T a 。进行分析及纯化工艺的探索 1 方法 1 1 合成T 吼的分离纯化 目的肽粗品经D E A ES e p h a r o s eF a s tF l o w 离子交换色谱和C 。制备型R P H P I 。C 进行分离和纯化 1 1 1 离子交换色谱选用D E A ES e p h a r o s eF a s tF l o w 阴离子型离子交换填料进行离子交换层析，缓 冲液为p H 8 0 的T r i s H C l ，o 0 3 5m o l I 。N a C l 离
3、子强度的线形梯度洗脱，部分收集后进行制备型R P H P I 。C 纯化 1 1 2 R P H P I 。C 采用制各型反相H P L C ，C 1 8 ( R a d i a l P a k ，8m m 1 0 0F i l m ，5U ，l O O ) 色谱柱，流动相A 为0 1 T F AH 。O ，流动相B 为0 1 T F A9 0 C H s C N ，线形梯度为1 0 3 5 B ，6 0r a i n ，流速20 m I ，r a i n ，检测波长2 1 4n r i l 1 2 合成T a 。的分析鉴定目的肽粗品经纯化后，采用分析型R P H P I 。C 和T r i
4、c i n e S D SP A G EE z 检测， 并进行氨基酸组成分析 1 2 1R PH P I 。C 分析 采用c ，。色谱柱，流动相A 为0 1 T F AH 。O ，流动相B 为0 1 T F A9 0 C H 。C N 仪器：分析型高压反相液相色谱H P l l 0 0 型美国惠普公司；色谱柱：P l a t i n u mC 。4 6 2 5 0i n m 1 0 0A5U ；流速：1 0m I 。m i n ；检测： 一2 1 41 1 1 1 1 1 2 2S D SP A G E 分析分别配制T - - 1 6 ，c 一3 的分离胶1 5m I ，T - - 1 0 ，
5、C - - 3 的成层胶6m I ， 和7 1 4 ，c 一3 的积层胶1 2 5m I 。，用于产品的电泳每层胶中丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例为3 2 ：1 ( a c r y l a m i d e ：b i s ) 1 3 活- | ! 生测定细胞增殖实验，采用3 H T d R 参人法 3 。 2 结果 二步纯化后的产品经R P H P I 。C 和S D SP A G E 检测，纯度达9 8 8 2 1R PH P L C 分析结果选择了合适的色谱条件，对纯化后产品进行H P I 。C 鉴定( 图1 ) ，得到目标肽色 谱峰的保留时间为2 2 0 4 0r a i n ，与相同色谱条件
6、下对照品日达仙保留时间2 2 0 8 4m i n 基本一致积分面 积得出纯品中胸腺肽a ，约占9 8 8 2 2S D S P A G E 电泳分析结果T r i c i n eS D S P A G E 凝胶电泳分析显示，纯化后的合成产品在与对照品 日达仙对应位置呈单一条带( 见图2 ) 基金项目：天津市自然科学基金重点资助项目( 9 9 3 8 0 4 3 1 1 ) 作者简介：韩香( 19 7 3 一) ，女，天津人，讲师研究方向：多肽药物化学E m a i l ：x i a n g h a n 2 6 3 n e t 1 4 0 广西师范大学学报( 自然科学版)第2 l 卷 - i
7、2 I 5I 2 S”1 54 1 f m l n F i g 1A n a l y s i so fP u r eS a m p l eo fT h y m o s i n u b yR P H P L C L a n e 2 F i g 2S D S P A G Eo ft h ep e p t i d es a m p l e f r o mt h es y n t h e s i s 1 合成T h y m o s i n a l 粗品，2 对照品日达仙， 3 合成T h y m o s i n a l 纯品 31 日记 在H P I 。C 中，不同大小多肽的保留时间可由组成多肽分子的
8、个别氨基酸及其端基的保留常数的加和 值来预测组成多肽的各氨基酸保留常数的加和值越大，则多肽的保留时间越长如估计的保留时间较长， 则洗脱液中有机溶剂含量应稍高些，但一般不超过6 0 ，因为高含量有机溶剂可能引起样品的变性；超过 6 0 后，许多肽的保留时间随有机溶剂增加而增加，对洗脱不利胸腺肽a t 的保留时间较短，采用线性梯 度洗脱时，流动相中有机溶剂的终点组成可稍低定5 0 ，起点组成定1 0 有机溶剂选用乙腈，因其在 2 1 0n m 附近有很好的透光度，洗脱能力也较强流动相中加入0 1 三氟乙酸( T F A ) 调p H 在2 3 范围， 保证多肽易于溶解，便于洗脱 多肽分子中发色团的
9、吸收波长大多在1 9 0 2 3 0n m 范围肽键的吸收峰在2 2 5i l m 虽然单个肽键吸 收强度不及芳香氨基酸，但分子中肽键数目占主要优势尤其胸腺肽啦的结构非常特殊，不含有芳香氨基 酸，因此，多肽的光吸收性主要由肽键决定，多肽的检测波长应选择在2 0 0 2 3 0n m 之间才能有较高的灵 敏度胸腺肽n 。的最强吸收波长为2 1 4n m 多肽制品纯度的鉴定通常采用的物理化学方法有：S D S 电泳法、等电聚焦电泳法、N 一末端氨基酸残基 分析、高效液相色谱、沉降分析、扩散分析等选用任何单一种鉴定法都不能确定多肽的纯度，必须同时采 用- 2 3 种不同的纯度鉴定法才能确定合成胸腺肽
10、a 。粗产品的纯度鉴定通过S D S P A G E 电泳分析和通 过R P H P L C 进行分析，纯度均一，达9 8 8 以上，体外生物活性与对照品日达仙相当 参考文献： 1 S u g a h a r aS ，I c h i d aT ，Y a m a g i w aS ，e ta lT h y m o s i n a l p h a li n c r e a s e si n t r a h e p a t i cN KTc e l l sa n dC T L si np a t i e n t s w i t hc h r o n i ch e p a t i t i sB J 3
11、 H e p a t o lR e s ，2 0 0 2 2 4 ( 4 ) ：3 4 6 3 5 4 2 S h iJ i h o n g ，Z h a oY o n g t o n g ，Z h a n gY i n g q i ，e ta 1 S t u d yo na n a l y s i n gm e t h o d so fl o wm o l e c u l a rp e p t i d e sw i t hS D S p o l y a e f y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e S l s J P r o gb i o t e
12、 c h n o l ，2 0 0 1 ，2 1 ( 1 ) ：3 8 4 1 3 S h iJ i h o n g ，Z h a n gY i n g q i ，Z h a oY o n g t o n g ，e ta 1 C l o n i n g e x p r e s s i o no ft h y m o s i na l p h a1g e n ei nEc o l ia n di t sp u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e n z a t l o n J C h i n e s eJ o u r n a lo fB i o c h
13、 e m i s t r ya n dM o l e c u l a rB i o l o g y ，2 0 0 1 ，1 7 ( 3 ) ：3 4 43 4 9 S T U D YO NT H EI S O L A T l 0 NA N DP U R I F I C A T I O NT E C H N I Q U E S O FS O L I D P H A S ES Y N T H E T I CT H Y M O S I Nd l H A NX i a n g ，G UJ u n ，Y U A NQ i n g l a n ，G A NY i r u ( M e d i c a lC o l l e g eo fC h i n e s eP e o p l e sA r m e dP o l i c eF o r c e s ，T i a n j l n3 0 0 1 6 2 C h i n a ) ( 责任编辑李小玲)
