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1、武汉大学 硕士学位论文 中药连翘有效部位体外抗单纯疱疹病毒的实验研究 姓名：刘颖娟 申请学位级别：硕士 专业：病原生物学 指导教师：杨占秋;刘建军 20040401 中文摘要 目的：筛选中药连翘抗单纯疱疹病毒l 型和2 型( H S v 一1 和H S V 2 ) 的有效部位， 并评价其抗病毒效果，从而为抗单纯疱疹病毒的感染治疗提供新的治疗手段。方法： 通过观察细胞病变效应和活细胞染色计数法( M T T ) ，研究了中药连翘6 、7 、8 、9 号部位 的有效成分在h e p 一2 细胞上，抗单纯疱疹病毒I 型和2 型的作用：通过四种不同有效 成分对病毒直接灭活，阻止病毒对细胞的吸附及抑制病
2、毒核酸生物合成实验，检测药 物的抗病毒能力并探索其抗病毒机制；比较不同有效成分在不同滴度下抗H S V 一1 和 H S V 一2 的作用差别；通过四种有效成分的T D 5 0 、T D 9 5 、E D 5 0 、E D 9 5 及T I 等药效学指 标，评价它们抗H S V 效果。结果：1 、四种提取物对H S V 1 和H S V 2 均没有直接灭 活和抑制其阻止其吸附敏感细胞的作用，但对两型病毒均有抑制其生物合成的作用。2 、 T D s o 反应了药物对细胞毒性作用大小，实验结果显示T D 5 0 9 ( 3 68 7 埘g m 1 ) T D 5 0 8 ( 3 0 7 6 聃g
3、m 1 ) T D 5 0 6 ( 2 6 3 7 砒g m 1 ) T D 5 0 7 ( 1 2 0 6 地I g m 1 ) ，表明了7 号有效部药物位有最 小浓度的对细胞毒性作用。E D 5 0 是药物对病毒抑制效果的重要指标之一，其值越小，说 明药物达到5 0 抑细胞C P E 效果所需浓度越小，实验结果显示E D s 0 9 ( 8 9 0 艰g m 1 ) E D 5 0 6 ( 8 6 3 l g m 1 ) E D s 0 8 ( 3 5 0 1 g m 1 ) 3 E D 5 0 7 ( 2 6 5 蝣g m 1 ) ，说明达到5 0 抑细胞 C P E 效果，7 号部位药
4、物所需药物剂量最少。T I ( T D 5 0 E D 5 0 ) 称为药物的治疗指数，是 药物的安全性指标，其值一定程度上反应药物的安全性越强。实验结果显示T 1 8 ( 8 7 9 ) T 1 7 ( 4 5 5 ) T 1 9 ( 4 1 4 ) T 1 6 ( 3 0 6 ) ，T 1 8 治疗指数最大。另一种较好的安全性指标是E D 9 5 ( 药物最强抑病毒效果剂量) 与T D 5 ( 理论无毒剂量) 之间的距离。比较四种提取部 位药物的E D 9 5 与T D 5 时发现：6 、7 号提取部位药物的T D 5 ( 6 8 7 、1 3 6 蛆g m 1 ) 小于其 相对应的E D
5、 9 5 ( 1 3 0 5 、4 4 5 埘g m 1 ) ，说明两种提取部位药物在理论无毒剂量范围 内都无法达到最好的抑病毒效果，其中6 号有效部位在小于T D 5 范围内的抑病毒 T D 5 0 6 ( 2 6 3 7 一g m 1 ) T D 5 0 7 ( 1 2 0 6 “g m 1 ) ，表明了7 号有效部药物位有最 小浓度的对细胞毒性作用。 E D s o 是药物对病毒抑制效果的重要指标之一，其值越小，说明药物达到5 0 抑细胞 c P E 效果所需浓度越小，实验结果显z 示E D 5 0 9 ( 8 9 0 t 6 g m 1 ) E D s 0 6 ( 8 6 3 掘g m
6、 1 ) E D 5 0 8 ( 3 5 0 i H g m 1 ) 3 E D 5 0 7 ( 2 6 5 始m 1 ) ，说明达N 5 0 抑细胞C P E 效果，7 号部位药物所需 药物剂量最少。 T I ( T D 5 征D 5 0 ) 称为药物的治疗指数，是药物的安全性指标，其值一定程度上反 应药物的安全性越强。实验结果显示T 1 8 ( 8 7 9 ) T 1 7 ( 4 5 5 ) T 1 9 ( 4 1 4 ) T 1 6 ( 3 0 6 ) T 1 8 治疗指数最大。 另一种较好的安全性指标是E D 9 5 ( 药物最强抑病毒效果剂量) 与T D ；( 理论无毒剂 量) 之间
7、的距离。比较四种提取部位药物的E D g s 与T D 5 时发现：6 、7 号提取部位药物的 T D 5 ( 6 8 7 、1 3 6 H g m 1 ) 小于其相对应的E D 9 5 ( 1 3 0 5 、4 4 5 N g m 1 ) ，说明两种提取 部位药物在理论无毒剂量范围内都无法达到最好的抑病毒效果，其中6 号有效部位在小 于T D 5 范围内的抑病毒 3 5 ；7 号有效部位在小于T D 5 范围内的抑病毒率 1 0 ；8 、9 号 提取部位药物I 拘T D 5 ( 6 7 9 、2 0 9 8 H g m 1 ) 大于其相对应的E D 9 5 ( 6 0 5 、1 3 2 唧g
8、 m 1 ) ， 说明这两种提取部位药物在理论无毒剂量范围内能达到较好的抑病毒效果，它们在抑 病毒的实验中，相L k 6 、7 号部位药物，有较好的安全性。其中9 号提取部位药物的E D 9 5 与T D 5 之间的距离较大。 抗病毒药物作用机制主要是通过抑制病毒D N A 复制，阻止病毒对细胞的吸附和对 病毒直接灭活三个方面来探讨：H S V 对很多理化因素敏感，病毒的囊膜含有相当多的 脂类，对许多脂溶剂如乙醚，去氧胆碱酸等敏感，某些酶类也能使病毒的囊膜变性而 灭活病毒；病毒表面受体与敏感细胞配体结合是病毒进入细胞的第一步，封闭或改变 岁受体配体也能阻止病毒对细胞的感染；病毒吸附宿主细胞后很
9、快穿入细胞内经融 合，脱衣壳释放D N A 首先以自身为模板合成早期蛋白，其功能主要是在D N A 指导下合 成D N A 聚合酶。另外抑制宿主细胞R N A 转录酶然后在D N A 聚合酶作用下。以D N A 为 摸板经转录、翻译合成晚期蛋白，再装配成完整的子代病毒毒颗粒，释放到细胞外 完成一个病毒的繁殖周期因此。药物只要能够有效地抑制其中某一个步骤，病毒核酸复 制和系列蛋白质合成的周期就会中止。 四种不同部位的药物对H S V 一1 和H S V 2 都没有直接灭活作用，也不能阻止病毒吸 附细胞，可以认为药物的四种不同提取部位对病毒没有直接的理化效果，且不会影响 或改变病毒和细胞表面的受体
10、和配体；H S V 1 型并I ：I H S V 2 型病毒的硷基序列有7 0 的同 源性，两者相关糖蛋白中，除H S V - I g G ，g C 和H S V 一2 9 G 分别具有特异性抗原决定簇外，其 他结构基本相同或相似。H S V - l 型年n H S V - 2 型在基因组和糖蛋白结构上的相似性提示 了当一种药物能抑制单纯疱疹病毒的一种型别的生物合成时，它很有可能对另种型 别也有抑制作用，在我们的实验中证明了这一点：连翘不四种不同的提取成分对H S V 1 型和H S V 2 型的生物合成都具有有抑制作用。 结论 1 、连翘四种有效部位对H S V 1 年D H S V 2 均
11、没有直接灭活和抑制其阻止其吸附敏感 细胞的作用，但对两型病毒均有抑制其核酸生物合成的作用。 2 、6 ，7 ，8 ，9 号有效部位的的T D 5 0 分别为2 6 3 7 ，1 2 0 6 ，3 0 7 6 ，3 6 8 7 弹g m l ，表明了7 号有效部位有最小浓度的对细胞毒性作用；E D 5 0 # 勋 Y s 8 6 3 ，2 6 5 ，3 5 0 ，8 9 0 剜g m l ；蜕明 达到5 0 抑细胞C P E 效果，7 号有效部位所需药物剂量最少。T 1 分别为8 7 9 ，4 5 5 ，4 1 4 ， 3 0 6 ，T 1 8 治疗指数最大。9 号有效部位E D 9 5 与T
12、D 5 之间的距离较大。 附图 图1 正常H e p - 2 细胞 F i gN o r m a IH e p 一2c e I8 图2 H S V 一1 所致的H e p 一2 细胞O P E F i g - O P Eo fH e p 2 c e Is b yH S l 卜1 参考文献 I P r i e t oJ M ，R e c i oM C ，G i n e rR l v l ，M a n e zS ，G i n e r L a r z aE M ，R i O S 儿I n f l u e n c eo f t r a d i t i o n a lC h i n e s e a n
13、t i - i n f l a m m a t o r y m e d i c i n a l p l a n t s o n l e u k o c y t e m a d p l a t e l e t f u n c t i o n s JP h a r mP h a r m a c 0 1 2 0 0 3S e p ；5 5 ( 9 ) ：12 7 5 - 8 2 2 C h e nX ，B e u t l e rJ A ，M c C l o u dT G ，L o e h f e l mA ，Y a n g L ，D o n gH F ，C h e r t o vO Y ， S a
14、l c e d o R ，O p p e r t h e i mJ J H o w a r dO M T a n n i ca c i di s a I li n h i b i t o ro fC X C L t 2 ( S D F _ 1 a l p h a ) C X C R 4 w i t h a n t i a n g i o g e n i ca c t i v i t y C l i n C a n c e rR e s 2 0 0 3 A u g 1 ；9 ( 8 ) ：3 1 1 5 - 2 3 3K i mM S ，N aH J ，H a nS W ，J i n J S ，
15、S o n gU Y ，L e eE J ，S o n gB K ，H o n gS H ，K i mH M I n f l a m m a t i o n 2 0 0 3J u n ；2 7 ( 3 ) ：1 2 9 3 5 4 S c h i n e l l aG R ，T o u m i e r H A ，P r i e t oJ M ，M o r d u j o v i c hD ，R i o s 几A n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f a n t i i n f l a m m a t o r yp l a n te x t r a c t
16、s L i f eS c i 。2 0 0 2J a n1 8 ；7 0 ( 9 ) ：1 0 2 3 3 3 5 R o u f A S ，O z a k iY ，R a s h i dM A ，R u iJ P h y t o c h e m i s t r y D a m m a r a n ed e r i v a t i v e sf r o mt h e d r i e df r u i t so f F o r s y t h i a s u s p e n s a 2 0 0 1A p r ；5 6 ( 8 ) ：8 1 5 8 6 - O z a k iY ，R u iJ ，T a n gY T B i o lP h a r mB u l l A n t i i n f l a m m
