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1、实 验 一,质粒DNA的提取及鉴定,背景理论知识,Section 1,掌握质粒信息和用途，学会自己看质粒图谱 掌握快速提取小量质粒DNA的方法 了解质粒DNA提取的基本原理 掌握琼脂糖凝胶电泳的方法,1.1.1 实 验 目 的,1.1.2 载 体,定义：基因工程中携带目的基因进入宿主 细胞进行扩增和表达的工具。 类型：大肠杆菌中的质粒、噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒载体等。,载体的基本条件,复制子：一段具有特殊结构的DNA序列，使与之结合的外源基因复制。 可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反应。 限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基因的插入。 适合的拷
2、贝数：较高的拷贝数不仅有利于载体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。,1.1.2 载 体,质 粒 载 体,是染色体外小型的双链环状的DNA，常用载体之一 自我复制 具有合适的限制酶切位点 筛选标记 可编码某些遗传性状 如抗药性、耐受重金属、产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外的特性 高拷贝数 小分子量1-200Kb 高稳定性,1.1.2 载 体,质 粒 载 体 的分类,根据用途分类,1.1.2 载 体,质粒（原核载体）,1.1.2 载 体,1.1.2 载 体,质粒（真核载体）,1.1.2 载 体,1.1.3 质粒提取一般步骤,细菌培养物的生长 细菌的收获和裂解 质粒DNA的纯化,质粒提取
3、的常用方法,碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同） 苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布） CsCl法（EB插入造成DNA浮力密度不同） SDS 裂解法（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清） 玻璃纤维膜法(试剂盒),1.1.3 质粒提取,碱裂解法提取质粒DNA,目的要求 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。,1.1.3 质粒提取,实验原理 根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。 当加入pH4.
4、8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。,碱裂解法提取质粒DNA,1.1.3 质粒提取,实验操作,Section 2,1.2.1 实验材料,含质粒载体（pET28a）和含目的基因质粒（pEGFP-N3）的大肠杆菌DH5a 溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris.HCl）（pH8.0） 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8 .0） 溶液II 0.4
5、mol/L NaOH， 2% SDS（用前等体积混合） 溶液III 5 mmol/L 乙酸钾 ， 冰乙酸 ，H2O,苯酚：氯仿（25：24） 氯仿：异戊醇(24：1) 无水乙醇， 70%乙醇(-20C保存) TE缓冲液: 10mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA(pH8.0) 胰RNA酶,1.2.1 实验材料,1.2.2 实验程序,1、细菌培养和收集 将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜。（已完成） 取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管）中, 10000rpm离心1min，吸去培养液。,2、细菌裂解及质粒的提取,将细胞
6、沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。 加200ul溶液II(新鲜配制),盖紧管盖,轻轻混匀内容物,将离心管放冰上5min。 加150ul溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻颠倒数次使混匀。冰上放置10min。 12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作好标记）中。,1.2.2 实验程序,向上清中加入等体积（450ul）酚:氯仿(1:1) （注意下层是有机相）,反复混匀。 12000rpm,离心2分钟,将上清小心地转移到另一离心管（标记！）中 加入等体积（450ul）氯仿:异戊醇 (24:1),反复混匀。 12000rpm,离心2分钟，取上清液于新的EP管中。,3、质 粒
7、 的 纯 化,1.2.2 实验程序,4、质粒的浓缩 加入2倍体积（900ul）无水乙醇,混匀后,室温放置10-15min。 12000rpm离心5分钟，倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀, 振荡并离心, 12000rpm离心2分钟，倒去上清液, 空气中干燥510min。,1.2.2 实验程序,5、质粒的溶解和保存 加20ul TE缓冲液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。 -20保存。,1.2.2 实验程序,样品保存,1A1 1A2 1B1 1B2 2A1 2A2 2B1 2B2 3A1 3A2 3B1 3B2,4 5
8、6,7 8 9,10 11 12,13 14 15,1.2.2 实验程序,6、质粒DNA的电泳检测,（1）琼脂糖凝胶的制备 每4人制备一块琼脂糖凝胶（9个泳道） 0.2克琼脂糖+20毫升TAE缓冲液，电炉融胶（充分溶解），稍微冷却加2lgoldviewna显示液，倒在电泳胶槽中，使胶凝固(20min)。,1.2.2 实验程序,（2）琼脂糖凝胶电泳 每人2个样品，pET28a和pEGFP-N3各一个。 取3l质粒DNA+1.0l点样缓冲液，在parafilm膜上混匀后全部点至琼脂糖凝胶孔（记住自己点样位置）。 接通电泳仪和电泳槽的电源(注意正负极)（-+） 恒压150V,电泳10-20分钟 紫外
9、灯下观察并记录结果(对面实验室拍照片) 分析结果。,1.2.2 实验程序,1.2.2 实验程序,实验关键点,溶液I加入后充分悬浮 溶液II一次性加入后轻柔地颠倒混匀 溶液III加入后轻柔地颠倒混匀 酚抽提后小心吸取上清 无水乙醇和70%乙醇不要弄混 微量加样器的正确使用,移液器（排气式和排液式）,1选择一支量程合适的移液器 2设置移液量 3装枪头 4检验移液量 5吸取一定体积的液体 6目测吸入枪头的液体体积是否合理 7释放液体 8退下枪头,实验要求： 每人提取质粒2份（pET28a和pEGFP-N3各一份） 溶液每大组一套 枪每2人一套 Tips 2人一套（3盒）,思 考 题,分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的特点是什么？ 分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？ 核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？ 在TE缓冲液中为什么要加入EDTA？ 纯化的核酸如有酚和蛋白质的污染的话，对它的后期操作有何影响？ 有哪些因素影响核酸的沉淀？,下 次 实 验,质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测,开始工作吧！ LETS BEGIN NOW！,
