《人类乳头状瘤病毒16 e7 dna及e7癌蛋白在结直肠癌组织表达的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人类乳头状瘤病毒16 e7 dna及e7癌蛋白在结直肠癌组织表达的研究（83页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、四川大学 博士学位论文 人类乳头状瘤病毒16 E7 DNA及E7癌蛋白在结直肠癌组织表达的 研究 姓名：张建成 申请学位级别：博士 专业：外科学（普外） 指导教师：周总光 20050428 英文缩写词表 ( L i s to f A b b r e v i a t i o n s ) C R CC o l o r e c t a lC A r c i n o m a Er e g i o n E 6 9 0 n e E 7g e n e 结直肠癌 E a r l yt r a n s c r i b i n gr e g i o n 早期转录区 E a r l yg o n e6 E a r
2、l yg e n e7 E 7o n c o p r o t e i nH P VE 7o n c o p r o t e i n H & E H e m a t o x y l m & E o s i n H P VH u m a np a p i l l o m a v i m s H P V 早期基因6 H P V 早期基因7 H P V E 7 癌蛋白 苏木素一伊红染色 人类乳头状瘤病毒 I H C I m m u n o h i s t o c h e n i s t r y免疫组织化学 I S H i ns i t uD N A h y b r i d i z a t i o n
3、Li r e g i o n P B S L i n et r a n s c r i b i n gr e g i o n D N A 原位杂交 晚期转录区 P h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e磷酸缓冲液 P C R P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 多聚酶链反应 p R b U R N P B S R e t i n o b l a s t o n h a t u m o rs u p p r e s s o r p r o t e i n 成视网膜细胞瘤抑癌蛋白 u p s t r
4、e a mr e g u l a t o r yr e g i o n上游调节区 P h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸缓冲液 声明 、7 9 2 8 6 0 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特g 自口以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四 川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，
5、论文成果归四川大学所有，特此声明。 申请人 指导教9 旃屯或 四J l I 大学临, W - 医学博士专业学位r e “ 文 人类乳头状瘤病毒1 6E 7D N A 及E 7 癌蛋白 在结直肠癌组织表达的研究 研究生：张建成 导师：周总光教授 摘要 背景和目的：结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率在所有 肿瘤中居第三位，病死率居第二位，是严重危害人类健康的恶性疾病， 但其发生、发展机制尚不明确。近年来研究发现，人类乳头状瘤病毒 ( h m n a np a p i l l o m av i r u s ，H p v ) 感染与多种肿瘤发生、发展有相关性，并同 益成为研究的热点。I -
6、r P V 是一类具嗜皮肤和粘膜组织特异性的双链环状 小D N A 病毒，主要感染人的皮肤或粘膜上皮细胞，与人类一些上皮源性 肿瘤的发生、发展有密切的关系。宫颈癌与H P V 感染的关系研究己较成 熟，在宫颈癌中H P V l 6D N A 的检出率高达9 0 。但结直肠癌与人类乳 头状瘤病毒感染的关系研究尚处于初级阶段，有关机理目前还不清楚， 是全肠道感染? 还是仅癌区感染? 是H P V 参与结直肠癌的发生和发 展? 还是在癌灶黏膜屏障破坏后继发的“H P V 伴随”感染? 人类乳头状瘤 病毒感染与结直肠癌的部位、T N M 分期、分化程度的关系如何? 这些问 题目前国内外的研究尚无明确报
7、道。因此，本课题采用大样本前瞻性对 照研究，对1 0 6 例原发性结直肠腺癌患者手术切除新鲜标本的癌及癌旁 正常粘膜组织，用多聚酶链反应( p o l y r n e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，P C R ) 检测 H P V l 6E 7 基因的表达，将扩增产物回收纯化，进行克隆，制各了含E 7 基因的质粒并测序，确认系人类乳头状瘤病毒的1 6 亚型的感染；用免疫 组织化学方法( I r m n u n o h i s t o c h e m i s t r y ，I H C ) 观察结直肠癌和癌旁正常 四J I l 大掌I 临床医掌博士专业掌位论文
8、黏膜组织中H P V l 6 E 7 癌蛋白的表达情况。旨在阐明不同部位、分期及分 化程度的结赢肠腺癌与H P V l 6 感染之间的关系。 方法：应用P C R 及免疫组化染色技术检测1 0 6 例手术切除的结直肠癌新 鲜标本及癌旁正常粘膜组织中H P V l 6 E 7 D N A 及E 7 癌蛋白的表达。 1 标本来源 标本均取自I g lJ i l 大学华西医院普外科2 0 0 4 年8 月至1 2 月手术切除 的原发结直肠癌病例，共1 0 6 例，均经病理证实为结直肠腺癌。同时取 距癌缘近端1 0C I T I 之正常结直肠黏膜组织( 结直肠癌根植术要求癌灶近 端切除正常组织超过1
9、0c m ) ，亦经病理检查证实为正常黏膜组织。患者 年龄2 6 8 1 岁，中位年龄5 6 岁，男：女为6 2 ：4 4 。患者术前均未经放疗、 化疗和免疫治疗。手术后，立即取癌组织及癌旁正常黏膜组织各2 份( 均 为O 5 x 0 5c m ) ，1 份用无菌生理盐水冲洗，冻存于一7 0 。C ，按B u y r u 等方 法提取D N A ，取l 肛g 用于P C R ；1 份用1 0 中性甲醛液固定后，做常规 石蜡切片，进行H E 及免疫组化方法检测H P V l 6E 7 蛋白表达。所有标本 均由同一个病理医生做出组织病理学诊断。 2 分组 根据癌灶部位分为升结肠癌组( 1 7 例)
10、 、横结肠降结肠癌组( 2 0 倒) 、 乙状结肠癌组( 2 7 例) 和直肠癌组( 4 2 例) ，共1 0 6 例。 3 P C R 检测I t P V l 6 E 7 D N A 以新鲜组织中提取的标本D N A 为模板，进行聚合酶链式反应，从 D N A 水平检测I L P V l 6E 7 在组织中的表达情况。H P V L 6E 7 特异引物：上 游引物( P 1 ) ：5 - C A C G T A G A G A A A C C C A G C T G T A A 一3 1 ；下游引物 ( P 2 ) ：5 - G C AG G AT C AG C CA T GG T A G
11、A T2 “ - 3 。阳性对照为整合有 H P V l 6 基因的宫颈鳞癌C a S k i 细胞株，引自武汉大学典型物培养保藏中 心( C C T C C ) ；阴性对照为不含D N A 的生理盐水。扩增产物回收纯化， 四JJ | 大学 留床医掌博士专业学位论文 克隆测序，以确认其与H P V l 6E 7 标准株序列一致。 4 免疫组织化学( I H C ) 方法检测H P V l 6E 7 癌蛋白 根据抗原抗体特异性结合反应，采用辣根酶标记链酶卵白素法 ( S A B C 法) ，一抗为鼠抗H P V l 6 E 7 蛋白单克隆抗体，按1 ：1 0 0 稀释， 同时设空白对照用P B
12、S 液代替一抗；用已知H P V l 6E 7 蛋白阳性的宫颈 癌组织切片做阳性对照。显微镜下观察结果，连续观察5 个1 0 0 倍视野， 以细胞核呈棕黄色的细胞数 1 0 萝1 J 断为阳性。将结果进行图像分析，半 定量检测抗原表达强度，从而在蛋白水平上明确H P V l 6E 7 的蛋白表达量 和组织定位。 5 统计学处理 计数资料采用f 检验，应用统计软件包S P S S1 10 进行分析。检验水 准“= O 0 5 。 结果： 1 结直肠癌组织中H P V l 6E 7D N A 的表达阳性率 1 1 结直肠癌及正常黏膜组织P C R 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，可见 一条清晰的3 0
13、 0b p 左右的条带。将产物回收、纯化，转染质粒后，进行 测序。所扩增片段为H P V l 6 原始序列第5 6 2 位到第8 5 8 碱基，基因全长 2 9 7b p ，测序结果与德国标准株完全一致。 1 。2 结直肠癌组织H P V l 6 E 7 D N A 的表达阳性率4 5 ，2 8 ( 4 8 1 0 6 ) 明显高 于癌旁正常粘膜组织6 6 0 ( 7 1 1 0 6 ) ，P 1 0 判为阳性。 ( 二) 统计学处理 采用卡方检验，应用S P S S l l 0 统计软件进行统计，并经计算机处理。 检验水准d = 0 0 5 。 结果 免疫组化染色检测H P V l 6E 7
14、 癌蛋白的表达结果： 1 用鼠抗人H P V l 6E 7 蛋自单克隆抗体免疫组化显示H P V l 6E 7 癌蛋白 主要在细胞核表达 棕黄色颗粒) ，部分在细胞浆表达( 见图7 、8 ) ，进 一步确认了H P V l 6 的感染。1 0 6 份结直肠癌标本有3 5 份标本有H P V l 6 E 7 癌蛋白阳性表达；而1 0 6 份癌旁正常黏膜组织标本只有2 份标本有阳性 表达。且E 7 癌蛋白阳性表达的标本均来源于与E 7D N A 表达阳性的组织 标本，但免疫组化方法检出的H P V l 6E 7 蛋白阳性表达率比P C R 检出的 阳性率低。 2 结直肠癌组织H P V l 6E
15、7 癌蛋白的表达阳性率3 3 0 2 ( 3 S 1 0 6 ) S f J , 显高 于癌旁正常粘膜组织1 8 9 ( 2 1 0 6 ) ，P 0 0 0 1 ，见表8 ；其中2 例直肠癌 四J 旦查兰! 堕堡堕兰苎圭! 些兰竺鲨查一 J h _ _ _ - _ _ - 一 的癌组织与癌旁正常黏膜组织均表达阳性。 3 直肠癌组织中H P V l 6E 7 癌蛋白的表达( 2 4 4 2 ，5 7 1 4 ) 明显高于升结 肠癌组( 2 1 1 7 ，1 1 7 6 ，P O 0 1 ) 、横降结肠癌组( 2 2 0 ，1 0 0 0 ，P O 0 1 ) 、 乙状结肠癌组( 7 2 7 ，
16、2 5 9 3 ，P O 0 5 ) ；癌灶部位从盲肠至肛门H P V l 6 E 7 癌蛋白表达阳性率有增高趋势，见表9 及图9 。 4 T N M 分期I I I 组与I 组H P V l 6E 7 癌蛋白表达阳性率之间差异有显著性 意义，P O 0 5 ) 。见表1 1 。 表8 结直肠癌组织与正常黏膜组织H P V l 6 E 7 癌蛋白的检出率 T a N e8E x p r e s s i o no f H P V1 6E 7O n c o p r o t e i ni nC o l o r e c t a lA d e n o c a r c i n o m 8 a l l d N o r m a lM u c o s a ! 婴! 竺 型 墅型! 竺韭型坐型坠一A d e r 、o c w c j n a 1 0 6 3 5 3 30 2 型! 竺型翌!
