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1、第三节 动物克隆克隆克隆(clone)(clone)是指通过无性繁殖的手段，从一个动物是指通过无性繁殖的手段，从一个动物细胞获得遗传背景相同的细胞群或个体群的过程。细胞获得遗传背景相同的细胞群或个体群的过程。获得的这些细胞叫克隆细胞，个体群称为克隆动物获得的这些细胞叫克隆细胞，个体群称为克隆动物(cloned animal)(cloned animal)。广义上的动物克隆就是指动物的无性繁殖广义上的动物克隆就是指动物的无性繁殖(asexual (asexual reproduction)reproduction)，即用无性繁殖的手段，即用无性繁殖的手段, ,由单一个体由单一个体产生外形、性能和
2、基因型完全一致的多个动物。产生外形、性能和基因型完全一致的多个动物。1.1 克隆技术产生的历史背景n1885年，Freiberg大学的动物学教授August Weismann提出了一种新的遗传学理论，他设想受精卵分裂后的每个子细胞只继承了母细胞一半的信息，以此来解释为什么来源于一个受精卵的机体细胞会变成各种各样的特化状态。n胚胎学家William Roux宣布他用试验验证了Weismann的遗传学理论。他用一个热针破坏掉2-细胞期青蛙胚胎中的一个卵裂球，最后发育成一半的青蛙。nHans Adolf Edward Dreisch企图在海胆上重复上述实验时，却得到完全相反的结果。他把2-细胞胚的两
3、个卵裂球分开，结果分别发育成完整的海胆个体。1 动物克隆发展简史n1902年，德国胚胎学家Hans Spermann用头发将蜥蜴2-细胞胚的两个卵裂球分开，得到与Dreisch相同的结果。n结论：这一时期的每个胚细胞拥有完整的遗传信息，可以产生完整的个体。n 1902-1903年间，Walter Sutton在蝗虫等动物上的研究发现，遗传信息的载体是染色体，染色体位于细胞核中，它在生殖细胞分裂中的行为是随机的。这一发现在人类对遗传现象的理解上具有里程碑的意义，也为孟德尔遗传定律找到了理论解释。1.2 克隆技术的创立n1928年，Hans Spermann在蜥蜴上完成了人类历史上第一次核移植实验
4、。他首先用一根头发把一个新受精卵勒住，将细胞核、细胞质各分一边，两部分之间的没有任何交流。拥有核有一半继续分裂增殖，等到16-细胞期时，松开头发套，让其中一个卵裂球细胞的核流入另一侧细胞质中。最后再把这两部分分开。结果发现，这个新建的细胞还能进一步发育成胚胎。这说明早期胚胎卵裂球细胞中，仍拥有全部的遗传信息，每个细胞都有指导发育成新个体的潜能。n1938年，Hans Spermann提出了克隆动物的设想：从一个分化细胞中提取细胞核，然后注入另一个去核的受精卵中构建新胚胎，他同时提出用体细胞进行动物克隆的思想，但一直未能付诸实施。n在此期间，1944年，Oswald Avery 在研究细菌转化现
5、象时，发现遗传信息存在于核酸中，而当时人们普遍认为遗传信息存在于蛋白质上。这一发现对整个生物科学，特别是细胞核移植研究产生了巨大影响。1.3 与克隆技术有关的重大成果n1952年，Robert Briggs和Thomas J.King用核移植方法克隆出了北美豹蛙的蝌蚪。n1953年，英国生物物理学家Francis Crick和美国生化学家James Watson共同发现了DNA结构。n1958年，Cornell大学生物学家F.E.Steward成功的用一个胡萝卜细胞培育出了完整的植株。证明植物细胞的全能性。n1961年，Francis Crick和Sidney Brenner发现，每三个核苷酸
6、碱基序列组成一个密码，特异的针对一个氨基酸。这一成果敲开了现代遗传学的开门。n1962年，Oxford大学生物学家John Gurdon宣布用已完全分化的南美青蛙蝌蚪的肠细胞核克隆出完整个体，后来又从成年蛙的皮肤角质细胞克隆出了蝌蚪。n1979年，德国生物学家Karl Illmensee宣布成功的克隆出了3只小鼠。n1984年，丹麦科学家Steen Willadsen成功的获得了第一例胚细胞克隆绵羊。n1986年 ， Wisconsin 大 学 的 Neal First和 Randal Prather等获得胚细胞克隆牛的成功。n此后，胚细胞克隆兔（Stice,1988; 黄少华，1993；王
7、斌 ， 1995） ， 大 鼠 （ Kono,1988） ， 猪（Prather,1989；赵浩斌，1997），山羊（张涌，1991），牛（李雪峰，1996），猴（Meng，1997）等相继取得成功。1991年，Westhusin等首先报道继代克隆胚胎可以正常发育到囊胚。1993年，Stice和Keefer获得了第一、第二、第三代继代克隆牛的出生。1995年，成勇等获得第二代克隆山羊。1998年张涌等报道了第一至第五代克隆山羊的成功。1995年，Roslin Ian 研究所的Wilmut Keith和Campbell用培养的胚盘细胞成功的克隆出了两只绵羊，表明已经有组织分化的细胞仍具有发育的全
8、能性。1996年，Wilmut和Campell等成功地从培养的绵羊乳腺细胞得到第一只成年体细胞克隆羊（Dolly）。随后几年间，体细胞克隆牛（Kono,1998;Wells,1999），小鼠（Wakayama,1998）,猪（Onishi,2000），山羊（张涌等，2000）等相继成功。History of Nuclear TransferWakayama et al. 1998Shin et al. 2002Meng et al. 1997 Baguisi et al. 1999 goatPolejaeva et al. 2000 Chesne et al. 2002 供核动物早期胚胎分割胚
9、胚胎分割胚胎干细胞分离与克隆胚胎干细胞核移植胚胎干细胞胚胎细胞核移植胚胎细胞胎儿成纤维细胞核移植胎儿成纤维细胞分离、传代培养与诱导归零体细胞分离、传代培养与诱导归零体细胞核移植供卵动物去核去核卵母细胞卵母细胞重组胚胎体外培养重组胚胎核移植图图1 不同类型克隆动物制作技术路线示意图不同类型克隆动物制作技术路线示意图克隆胚胎移植胚胎移植受体动物克隆动物2 动物克隆技术程序n2.1 供核细胞的选择和处理n2.1.1 胚胎卵裂球作为核供体n原 理：早期胚胎卵裂球细胞是全能性的，是一种未分化的细胞。n面对问题：供核细胞如何选择？n解决途径：一般选择桑椹胚前的细胞或后期胚胎中的内细胞团(inner cel
10、l mass)n面对问题：如何协调卵母细胞质与植入的细胞核之间的相互作用？n解决途径：研究发现，与卵母细胞周期处于同一时期的核能更好的实现再程序化(reprogramming)。早期胚胎的卵裂球细胞可能处于各种时期，因此可用一些化学试剂对胚胎细胞进行诱导，而使它们的周期同步化。n方法一：M期同步法。常用噻氨酯达唑（nocodazole）、乙酰甲基秋水仙碱（colcemid）。n方法二：G1期同步法。阿菲迪霉素（aphidicolin）和羟基脲(hydroxyurea)。可使胚胎细胞分裂停止在G1/S转折期。n方法三：G2期同步法。放线菌酮（cycloheximide，CHX）、6-甲基氨基嘌呤
11、（6-dimethylaaminopurine，DMAP）。2.1.2 胚胎干细胞作为核供体n胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES）来源于早期胚胎内细胞团，具有与内细胞团细胞相同的发育潜能和正常核型，又可以在体外增殖。n面对问题：ES细胞系的建立。n研究现状：小鼠上已建立起ES细胞系，并有传代至12代的仔鼠产生（Nagy,1993），但在家畜上至今尚未有真正的ES细胞核移植体系建立。在猪（Gerfen,1995）、绵羊（Wells,1995）、牛(Saito,1992)及灵长类(Thopmsom，1995)上已有ES样细胞系的建立。2.1.3 体细胞作为核供体n面对问题：
12、供体细胞与受体细胞的周期同步化。n对于给定的卵母细胞周期，只有处在正确周期状态的供体细胞，才有可能进行发育。以常用的M期卵母细胞为例，如果将处于G1期供体细胞核进入其中后，在MPF作用下，发生核膜破裂（nuclear evenlop breakdown, NEBD）、染色体超前浓缩（premature chromosome condensation，PCC）、核膜重新出现和类原核的形成（pronulcear formation, PN）等现象。核重建后仍为2倍体，能够进行正常的DNA合成及细胞分裂；如果移入的供体细胞核处 于G2期，上述现象仍发生，但由于G2期核为4倍体，因此无法正常发育；处于
13、S期的供体细胞核进入卵母细胞后，由于染色体倍型紊乱，也不能进行后续的发育。n解决途径：1.血清饥饿法。2.某些化学试剂处理。如 阿 菲 迪 霉 素 （ aphidicolin） 、 丁 酸 内 酯 -(butyrolactone-)。可以使大部分细胞阻滞于G1/S期。n影响因素：除了周期状态对供体细胞的核移植效果影响外，源于同一原代细胞的亚克隆系细胞之间，也因细胞基因的甲基化情况、乙酰化情况，染色体的完整性，细胞周期等不同，重构胚的发育能力也不同。另外，细胞类型不同，核移植成功率也存在差异。2.2 受体胞质的选择和处理n2.2.1 卵母细胞在动物克隆中的作用n在克隆中，供核细胞的全能性是基础，
14、但这种全能性只有在特定的条件下才能实现。这一特定条件就是卵母细胞。研究发现：早期胚胎的发育首先是由母型信息调控（maternal regulation）的，直到合子型基因被 激 活 ， 才 能 过 渡 到 合 子 型 调 控 （ zogotic regulation）。也就是要经过由母源控制向合子型控制胚胎发育的转变（maternal-zygotic transition, MZT）。n2.2.2 卵母细胞的成熟及生物调控。n卵母细胞中的RNA合成。n卵母细胞中的蛋白质合成。n卵母细胞成熟分裂能力的获得。n卵母细胞成熟分裂的阻滞。n卵母细胞成熟分裂的启动。n卵母细胞成熟分裂的调控。n2.2.3
15、 胞质成熟n在核成熟过程中，胞质中也发生一些非常重要的事件，以满足合子的正常发育，这一过程称之为胞质成熟（cytoplasmic maturation）。包括蛋白质的合成及磷酸化、能量代谢机制的发育和激活等。n2.2.4 卵母细胞的体外培养n2.2.4.1 卵母细胞的获取n途径一：通过超数排卵收集活体动物的成熟卵母细胞。n途径二：通过体外成熟培养获得卵母细胞。n2.2.4.2 卵母细胞成熟培养液n常用的是TCM199+动物血清+FSH/LH+E2。随着研究的深入，不断有新的改良方法出现。n2.2.4.3 卵母细胞成熟的标志n目前一般以排出第一极体作为卵母细胞成熟的标志。n2.2.5 卵母细胞的
16、激活n成熟后的卵母细胞停滞于M期，自然条件下，当精子穿入（受精）后会激活卵母细胞，启动一系列生化事件和形态变化。n面对问题：核移植胚是怎样被激活的？n解决途径：n途径一：电激活。电脉冲剌激是最经典、应用最为广泛的卵母细胞激活方式。细胞膜在瞬间高压电流脉冲的作用下，激发穿孔，从而使细胞内外的离子和大分子物质发生短暂流动，其中钙离子的内流会导致卵母细胞活化。n途径二：化学物质激活。包括乙醇、钙离子载体A23187（Calcium ionophore A23187, CaA）、离子霉素（Ionomycin）、Sr2+、Thimerosal(THI) 、Dithiothreitol(DTT)、三磷酸肌
17、醇、精子因子（sperm factor, SF）（精子的提取物）。n2.2.6 卵母细胞去核n卵母细胞去核成功与否是核移植的重要环节。目前最常用的是通过显微操作去核，另外还有化学试剂诱导去核法、高速离心去核法、紫外线或激光照射使染色体失活去核法等。n2.2.6.1 显微操作去核法n方法一：McGrath法（1983）。具体过程是：先用细胞松弛素B和/或秋水仙素处理卵母细胞（使细胞膜韧性增强），然后将微吸管插入卵周隙中靠近第一极体的位置，连同第一极体一起吸除附近的部分细胞质。以后Tsunoda(1988)采用荧光染料Hoechst33342先行染核，在操作中或完成后可在荧光显微镜下检测去核效果，
18、使去核率大大提高。n方法二：Willadsen法（1986）。具体过程为：先用玻璃针在极体附近把透明带切一小口，再用钝端微细管吸除约一半的细胞质，选用无核的一半作为核受体。Dr. Karen Moore Using the lab micromanipulatorMicromanipulatorUsed for enucleation and cloningn方法三：Oldenbourg(1996)法。原理是纺锤体具有很强的双折射性，在偏振光下可以观察到。因此，在显微镜中安装一个偏振光系统，然后将所获得图像资料输入分析软件处理后，便可在显示器上反映出M期染色体体所在位置，再行去核。n方法四：末
19、期去核法。先对卵母细胞激活，待第二极体排出后，吸除第一极体及其附近10-20%的胞质。n2.2.6.2 化学试剂诱导法。卵母细胞激活处理后孵育一段时间，在第二极体开始形成时，再用含Demecolcine（脱羰秋水仙碱）的液体孵育，可使大部分染色质随第二极体排出，达到去核效果。Nuclear TransferTraditional MethodThe Piezo Method is an alternative. It requires lysis of the donor cell then recovery of nucleus for transfer to enucleated oocy
20、te.2.3 克隆胚的构建n克隆胚胎的构建就是将供体细胞核和受体卵母细胞结合形成新的胚胎的过程。目前常用的有电融合法和细胞（核）直接注射法。n2.3.1 电融合法 n原理：两种细胞的膜在一定强度的垂直电场作用下，可以发生融合。n操作步骤：将待融合的细胞置于含融合液的两个电极之间，然后施以一定强度的脉冲剌激，细胞膜就可以融合。n影响融合率的因素：融合液、电场强度及脉冲时间。2.4 核质互作与细胞核的再程序化n2.3.2 细胞（核）直接注射法n直接将供体细胞（核）注射进卵母细胞质即为直接注射法。n2.4.1 细胞核的再程序化n供体细胞核进入卵母细胞后，核质之间相互作用而发生一系列生化事件，供体细胞
21、基因在结构和功能上进行重塑，即再程序化（reprogramming），重新启动分化发育的进程。n细胞的再程序化主要表现在下列几个方面：nA核膜破裂、染色体凝集、原核形成：供体细胞核进入激活前的卵母细胞（M）后，由于MPF的作用，会发生NEBD、PCC及原核形成等现象。使用激活的卵母细胞(后/末期)后，则没有PCC及核膨胀的发生。nB早期胚胎发育必需基因的表达：早期胚胎发育时一些基因的表达是其进一步发育的基础。如Oct-4,Fgf4,Rexl,Fgrf2等。nC 能量代谢相关基因的表达：乳酸脱氢酸（LDH）、三羧酸合成酶、磷酸果糖激酶（PFK）等是重要的代谢酶，这些酶能否正确表达对核移植胚的正常
22、活动至关重要。因此，可以通过检测这些酶的mRNA活性来判断胚胎的发育状况。nD端粒及端粒酶：端粒（Telomere）重复序列为（TTAGGG）n，位于哺乳类染色体的末端，对维持染色体的完整性是必须的。正常体细胞在分裂过程中，端粒序列会一代代的缩短，从而决定了细胞的寿命。这是由端粒酶活性变化所致的。生殖细胞、早期胚胎细胞以及大多数癌细胞中，端粒酶具有活性，由它催化补充端粒序列的长度；而大多数体细胞中端粒酶活性消失，端粒逐渐失去。n2.4.2 核质互作n核质互作的协调受到供体细胞和受体卵母细胞及其相关各种因素的影响。nA供核细胞方面：细胞类型、分化状态、周期、DNA的完整性。nB卵母细胞方面：卵母
23、细胞的质量、周期、激活的时间与方式。n其中DNA的完整性与卵母细胞的质量是决定核移植成功的最主要因素。nC供、受体细胞的周期协调：也就是如何选择核质融合与重构胚的再激活时间问题。3胚胎的体外培养n胚胎的发育是一个受能量、激素、生长因子及细胞因子等多重因素影响的动态过程，尽管胚胎体外培养已有30多年的历史，但至今为止尚不能完全模仿体内环境，以适应早期胚胎发育的需求。4 克隆技术存在的问题及前景展望n4.1 存在问题n尽管有克隆动物出生的报道，但总体效率还是很低。即使有动物出生，也存在着死亡率高、生理异常等问题。因此，这项技术尚处于发展完善之中。n4.2 前景展望n克隆是动物繁殖育种的新概念。它的不断完善与发展，不仅有重大的理论意义，而且有巨大应用前景。nA 动物育种nB 疾病防治nC 濒危动物保护nD 器官移植nE 转基因动物n
