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1、第一章绪论蛋白质组学是研究蛋白质或应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科蛋白质组学与基因组学的区别和联系蛋白质组学的研究意义：蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。几乎所有的生理和病理过程，以及药物和环境因子的作用都依赖于蛋白质，并引起蛋白质的变化。反之，对蛋白质组变化的分析也能提供对上述过程或结果的重要信息。蛋白质组学的研究手段也可以应用于农业研究、环境保护等多方面。蛋白质组学的研究目的及内容：研究目的主要有：分离蛋白，显示差异，将表现型与功能联系起来；寻找蛋白质之间的相互作用，动态地反映生物体所处的
2、状态。研究内容主要包括：（1）.蛋白质组研究体系的建立与完善：（2）.重要的生物学问题有关的功能蛋白质组研究：该部分内容涉及确定蛋白质、翻译后修饰的研究、功能的确定、分子药学、二维凝胶的差异显示、蛋白质蛋白质相互作用的研究、蛋白质胞内分布与移位等。蛋白质组学研究的必要性？基因组计划的研究存在局限性，体现在：1）基因序列本身的局限性，并不是所有基因同时表达，而是根据环境和生理状况而定，即使知道全序列也不能完全清楚表达状况。2）尽管通常情况下mRNA表达丰度决定了对应的蛋白质量，但是不能仅仅以mRNA的数据为基础预测蛋白质表达水平。蛋白质动态修饰和加工并非必须取决于基因序列，许多调节是在蛋白质的结
3、构域中发生。这些修饰和结合通常是动态和可逆的，而且不能由基因序列来决定。蛋白质的研究路线主要有两种：第一种：传统的凝胶电泳分离，胶内酶切与质谱鉴定技术相结合；第二种：将混合蛋白酶切，经过适当的色谱分离手段，对肽段进行质谱分析，并据此实现蛋白质的鉴定。蛋白质组学的研究流程:基本线路：制备组织、细胞等蛋白质样品，然后大模分离、分析和鉴定1确定研究对象2采用哪些分级分离技术3如果鉴定蛋白质4利用蛋白质生物信息学。蛋白质组学的分类：1）表达蛋白质组学：蛋白质表达谱（组织、器官、细胞、亚细胞分布等）； 2）比较蛋白质组学：比较不同蛋白质组的差异与相似性；3）结构蛋白质组学：蛋白质三维结构的解析；4）功能
4、蛋白质组学：蛋白质的功能和相互作用；5）蛋白质组学研究的技术平台与生物信息学：分离、鉴定技术，分析软件和数据库。蛋白质组学的研究技术与路线：路线：样品制备与分离；图像分析；蛋白质成分的分析与鉴定；数据库检索国内外蛋白质组学研究现状蛋白质组研究的（三大支撑技术）：双向凝胶电泳为主的蛋白质分离技术（使数以千计的蛋白得到有效的分离）；质谱技术为主的蛋白质鉴定技术（精确测定生物大分子相对质量及多肽序列）；计算机为基础的图像分析及相应数据库分析蛋白质的相互作用：不仅仅是“连锁反应或级联反应”，而是一个复杂交错和精密调控的反应网络；人体内蛋白质相互作用的总数“人类相互作用组”。重要性：通过相互作用，参与众
5、多重要生命活动（如生物催化、转运、信号传导、免疫、细胞调控等）；绝大多数疾病都是由若干种特定蛋白质之间异常的相互作用所致。蛋白质及其研究的重要性：1、蛋白质是一切生命活动的执行者只有蛋白质才是生物最终表型的决定因素。）2、蛋白质的结构和形状影响着自身功能、所在细胞甚至生物体的命运。3、各种疾病都有蛋白质谱的动态变化4、传统的对单个蛋白质的研究方式已无法满足后基因组时代的要求。蛋白质组学在植物、动物、微生物等方面的应用蛋白质组学的发展趋势蛋白质组学面临的挑战蛋白质组学研究的策略主要有哪些主要有两种策略，即依赖于分离的策略和不依赖于分离的策略。1）依赖于分离的研究策略主要有：二维凝胶电泳结合质谱的
6、研究方法；一步分离即一维凝胶电泳结合喷雾质谱的方法；其它垂直分离方法包括液相色谱和毛细管电泳等。2）不依赖于分离的研究策略主要包括：蛋白质芯片方法、蛋白质识别分子方法如抗体抗原反应和噬菌体显示等。第二章 蛋白质的结构与功能蛋白质：是由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的种类、数目及排列顺序。蛋白质的二级结构：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。蛋白质的
7、三级结构：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。蛋白质的四级结构：蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四分子伴侣通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象级结构蛋白质的生物学重要性蛋白质具有重要的生物学功能、蛋白质的分子组成蛋白质的分子结构蛋白质结构与功能的关系蛋白质的理化性质蛋白质的含量测定蛋白质空间结构改变与疾病蛋白质的分离纯化：基本原则1）获得尽可能多的样品蛋白2）不同的制备方法配合使用3）制备的方法与后续研究相结合蛋白质空间结构测定第三章 蛋白质组研究方法蛋白质组研究的步骤大规模的蛋白质分离技术二维凝胶电
8、泳（2D-PAGE）的主要步骤和原理，缺陷与面临的挑战概念：一种平板电泳技术，样品各组分先在第一方向分离(对蛋白质常用等电聚焦法)，然后在与第一方向成90度的第二方向作电泳分离。是蛋白质组学中的重要研究手段。主要步骤：样品制备；IPG胶条重泡涨及上样；第一向：IEF；IPG条平衡；平衡缓冲液(还原)、平衡缓冲液(巯烷基化)；第二向：SDS-PAGE；胶条染色；成像及图像分析。原理：在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质等电点和相对分子量的不同将蛋白质分离开。样品制备原则：尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质的损失；细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降解，从特殊亚细胞器提取蛋白还需
9、分级分离；样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80C，不要反复冻融样品；通过超速离心清除所有的杂质，主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等；加入尿素之后，加温不要超过37C，以防蛋白质氨甲酰化主要干扰物质：盐：增加导电性，使得等点聚焦所需时间延长，出现电内渗现象，导致胶内不均匀的水分布；离子去污剂（SDS）：影响第一维等点聚焦；核酸：通过静电作用与蛋白结合，妨碍聚焦过程；可阻碍丙烯酰胺基质孔道；脂类：通过疏水作用与蛋白结合，影响等电点及分子量，蛋白-脂类复合物在水溶性溶液中不溶解；多聚糖：会阻碍丙烯酰胺基质孔道；酚类复合物（植物）：通过氢键与蛋白结合。不足：膜蛋白
10、、碱性蛋白、低丰度蛋白的分离与检测；重复性以及规模化和自动化的问题等；改进：2-DE样品的预处理；2-DE后的蛋白点的检测研究等双向电泳中第一向到第二向进行平衡过程的机理？平衡buffer1：还原(将SS键转化为SH)，DTT；平衡buffer2：烷基化物(使每个SH均烷基化以防止SS键的重新形成),碘乙酰胺双向电泳第一向进行胶条水化时的两种方式是什么？各有什么特点？（1）主动水化：低电压可以让高分子量的蛋白更好地进入胶条；2）被动水化：蛋白自然地进入胶条；用于高盐浓度的蛋白样品；水化后,在电极处使用滤纸片除盐，如果在水化前使用滤纸片会导致蛋白被吸附在滤纸片上色谱质谱技术HPLC基本概念与特点
11、概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器，从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分离分析手段。特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。色谱法分离原理：当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。HPLC的分类
12、：化合物的极性、电荷、分子大小、旋光性四种主要的性质可以用来产生高效液相色谱分离。按固定相分类：液液色谱法LLC；液固色谱法LSC。按分离机理分类：分配色谱法；吸附色谱法；离子交换色谱法；分子排阻色谱法；化学键合色谱法；亲合色谱法；胶束色谱法。结构：高效液相色谱仪由五大部分组成：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和色谱工作站二维色谱串连质谱技术（2D-HPLC-MS-MS）步骤：样本蛋白质混合物-蛋白酶裂解-二维色谱分离-质谱分析鉴定蛋白质。优势：识别和鉴定低丰度蛋白、膜蛋白、酸性蛋白、碱性蛋白以及相对分子质量大的蛋白质。不足：通过蛋白质直接酶切得到的肽段混合物过于复杂，较难实现对细胞
13、全部蛋白质的识别与鉴定同位素标记（ICAT）-亲和色谱-质谱技术方法：蛋白质进行ICAT试剂标记-蛋白酶切-亲和色谱分离（只有被同位素标记的肽段能被色谱柱保留）-进入质谱进行鉴定。优势：可以实现对不同条件处理的细胞差异蛋白质的定量分析，而且大大简化了被分离样品的复杂程度不足：无法分析和鉴定不含半胱氨酸的蛋白质；试剂的高价位一维电泳（色谱）质谱技术高通量蛋白质鉴定技术：生物质谱技术；2-DE胶上蛋白质识别与鉴定技术生物质谱新技术：带MALDI源的四极杆飞行时间质谱仪(MALDI QqTOF)；MALDI-TOF-TOF质谱仪第4章 蛋白质的提取与分离蛋白质的提取细胞裂解的方法：温和裂解的方法：冻
14、融，渗透，去污剂，酶消化法，匀浆法；剧烈的细胞裂解方法：超声波，玻璃珠，研磨法；蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解蛋白质裂解液使用还原剂、去污剂及变性剂的作用分别是什么，熟悉经常用到的试剂？1）去污剂：有助于溶解膜蛋白质，并有助于膜蛋白质与脂类的分离。常用的有离子型去污剂，非离子型去污剂，两性离子去污剂。2）变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。常用的有尿素和硫脲。3）还原剂：用于还原二硫键或防止蛋白质氧化，增加蛋白质的溶解性。常用的有具游离巯基的巯基乙醇，二硫苏糖醇和不带电荷的三丁基膦。蛋白质裂解液中加入两性电解质的作用：1）起载体作用2）
15、捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性常用的蛋白酶抑制剂1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度1mM，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作浓度4mM，作用于PMSF相似，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的等电点。3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作浓度为1mM，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。蛋白质沉淀步骤：清除影响二维电泳图谱的杂质蛋白样品的制备的重要性、制备的基本原则以及过程是什么重要性：蛋白质组样品分离成功的关键，直接影响蛋白质组研究结果，样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。基本原则：尽可能提高样品溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；解除蛋白质之间以及与其它生物大分子的相互作用，使蛋白质完全处于变性状态和还原状态；减少对蛋白质以及蛋白质组的人为修饰。总之：尽可能简单，减少步骤一般过程：对细胞、组织等样品进行裂解、蛋白质进行溶解、变性、解聚，除去非蛋白质部分，提取全部蛋白质。样品制备的分类可溶性样品制备：如血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。组织样品制备；细胞样品制备：体外悬浮培养生长的细胞或周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细胞）；样品分级：真核生物组织蛋白质蛋白
