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1、,黑龙江生物科技职业学院,生物制药技术,生物分离技术,主讲人：张爱华,实训二、制备谷光甘肽,实验原理,2,材料用具,3,操作方法,4,目的要求,2,1,5,5,注意事项,目的要求,了解树脂柱纯化法制备谷光甘肽的基本原理； 熟悉树脂柱具体应用技术；,掌握多肽类生化物质提取纯化的基本操作技术。,原 理,谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三 肽。自然界中谷胱甘肽主要存在于酵母、谷物种子 胚芽，人体和动物的心脏、肝脏、肾、肌肉、血液 的红细胞和眼球中。动物组织中含量较高，而植物 组织中的含量较低。正常人体内还原性谷胱甘肽 （GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSHG）的比例为 100：1，还原性谷胱甘
2、肽（GSH），分子小，是 机体内重要的活性物质，它具有清除自由基、减毒、 促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA 的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生 理功能。在医学上、食品行业及运动保健上具有广 泛的应用。,制备谷胱甘肽（GSH）的方法，国内主要为酵母 菌生物合成，每克酵母菌干细胞含GSH 18mg。 所采用的分离提纯GSH的方法主要有两种，铜盐 法和离子交换树脂法。本次实训采用市售或经发 酵法制得的干酵母为原料，经加热提取，离心除 杂质，阳离子树脂交换、有机溶剂沉析等分离纯 化得GSH湿品，经真空干燥后即得GSH成品。,原 理,材料用具,干酵母 100g ；732阳离子交换
3、树脂（6080目）,5molL 30mL 、1molL 3000mL的硫酸溶液，2molL、 1molL盐酸溶液、丙酮 、硅藻土、2molL氢氧化钠、 2偏磷酸溶液、5碘化钾溶液、淀粉指示剂、 0.001 molL的碘酸钾溶液。,低温冰柜、冷冻离心机、不锈钢锅、搪瓷桶、冷冻干燥 机、温度计、酸度计、层析柱、布氏漏斗、电瓷炉。,提 取,将干酵母置于不锈钢锅中，在搅拌的条件下加入3倍体积的蒸馏水，再加入6倍体积沸腾的蒸馏水，升温至90100，保持10 min，然后速冷至210。,粗 提 液,用5molL硫酸调节pH值至2.83.0，冷冻离心（3000 rmin, 510） 15 min，收集离心液
4、。在离心液中加0.5硅藻土助滤，抽滤得到黄色抽提液待用。,粗 提 液 层 析,抽提液上732阳离子交换树脂柱，流速6 mLmin，然后用1 molL硫酸洗脱，洗脱流速2 mLmin,25 min左右开始收集5mL流出液,进行快速含量测定,当流出液滴定值超过0.2 mLmL时，开始收集，滴定值低于0.2 mLmL时停止洗脱。,粗 提 液 层 析,（1）732阳离子交换树脂装柱 将市售732阳离子交换树脂磨碎，筛选出6080目。物理方法处理后，先以4倍树脂体积的2molL盐酸搅拌浸泡2h，反复用水洗至近中性后，再用4倍体积的2molL氢氧化钠溶液搅拌浸泡2h，反复用水洗至近中性后，再用4倍树脂体积
5、的2molL盐酸搅拌浸泡2h，最后水洗至中性。按要求装柱后用1 molL硫酸平衡备用。 （2）GSH含量快速测定（碘量法） 取5 mL待测样品，置于250 mL锥形瓶内，加入5 mL 2偏磷酸溶液，1 mL 5碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂，用0.001 molL的碘酸钾溶液滴定至溶液由无色变为蓝色止。 计算滴定值（碘酸钾溶液待测样品，mLmL）,沉 析,将洗脱液倾入搪瓷桶中，在搅拌的条件下加入溶液体积10倍的冷丙酮（28），然后静置沉淀过夜，过滤收集沉淀。,干 燥,将沉淀置于真空干燥器中干燥，即得成品。,注意事项,用硫酸调节pH值时，应用酸度计边测边调。 保证其准确性。,2.离子交换树脂柱层析时应根据滴定值来确定 收集洗脱液的间隔时间，随着洗脱时间的增加， 收集洗脱液的间隔时间应逐渐缩短。,思考 题,1绘制出GSH标准曲线能否快速确定滴定值 的大小？如何绘制出GSH标准曲线?,2提取时为何加热后又要速冷？,你只闻到我的香水，却没看到我的汗水。 你否定我的现在，我决定我的未来！ 你嘲笑我一无所有，不配去爱，我可怜你总是等待。 你可以轻视我们的年轻，我们会证明这是谁的时代。 梦想是注定孤独的旅行，路上少不了质疑和嘲笑， 但那又怎样？ 哪怕遍体鳞伤，也要活得漂亮！,
