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1、放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法 刘星华 2011-5-13 药理室讲座 内容 l实验定义与原理 l实验材料与仪器 l实验方法 lScatchard方程与作图（饱和与竞争实验） lRBA的安全问题 l实验举例 实验定义与原理 l定义 l放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析 （radioassay of receptors），它是应用放射性核 素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和 力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法 。 l原理 l放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细 胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基 充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后， 用
2、过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测 定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基 结合的受体的量。 RBA的分类 RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体 进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性 和定量的分析。 l 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性 等。 l 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质 的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或 细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。 实验材料与仪器 实验材料 l动物组织（皮层、海马、纹状体
3、等） l仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高 速离心机、电热恒温水温箱、-80冰箱、 制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） l材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪 头、微纤维滤纸等） l药品（放射性配基、各种非标计化合物等 ） 实验仪器 l组织匀浆机 lIKA，T10B S25 l漩涡混合器 lWH-2 l低温高速离心机 l凯达，TGL20M l超低温冰箱 l海尔 l数显恒温水浴锅 l金燕，HH-S26S l制冰机 lGELIN l型号IMS-50 automatic ice flakes 电热恒温水温箱 l循环水式多用真空泵 l液闪测定计数仪 lHIDEX， 425-034型
4、实验材料 l2ml离心管 l6ml一次性软试管 枪头 1ml 10ul 200ul lTris lPPO与POPOP 过滤装置 l砂芯过滤装置（抽滤 瓶） l1000ml lWhatman GF/C玻璃 微纤维滤纸 l40mm 放射性化合物 l放射性配体 l低温保存 实验方法流程 实验方法流程 1、制备受体样品； 2、加样、温育进行结合反应； 3、终止反应，分离结合物与游离物 4、测定结合物的放射性； 5、数据处理。 实验具体操作（D1、D2、5-HT） l1、配制各种缓冲液及试剂 l按处方配比配制各种缓冲液贮备液 l配制各种非标记配体溶液 l配制各种受试药物溶液 l注意：该项操作所需试剂或仪
5、器 l仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶 、试管、EP管等 l试剂：无水乙醇、超纯水、Tris 、抗血酸、优降 宁、HCl 、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2 、DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、 Butaclamol及5HT 等 2、制备膜受体 l大鼠断头取脑 l分离出目标组织 l加10倍体积（V / W）冰冷的缓冲液 l用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 l组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次， 每次20分钟 l弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用 l注意：该项操作所需试剂或仪器 l仪器：手术
6、器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低 温高超离心机 l试剂：超纯水 3、加样 l取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定 浓度的膜受体溶液。 l取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 l按以下顺序及比例加入各种反应液。 l（1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 l（2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 l（3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体 l注意：该项操作所需试剂或仪器 l仪器：移液枪
7、、烧杯、量筒、EP管等 l试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液 4、 受体配体结合反应 l以上各管在加完放射性配体后，立即放入 37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后 把各管放入冰中终止反应。 l注意：该项操作所需试剂或仪器 l仪器：恒温水浴锅，制冰机 l试剂：无 5 、分离游离及结合的放射性配体 l上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装 置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲 洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随 后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁 液，浸泡过夜。 l注意：该项操作所需试剂或仪器 l仪器： 抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液 闪杯 l试剂： 甲苯、PPO 、POPO
8、P 6、 测定结合型放射配体每分钟放射计数 l采用放射性计数仪，测定各测试管中结合 型放射配体每分钟放射计数 l注意：该项操作所需试剂或仪器 l仪器： 液闪仪 l试剂： 无 7、数据处理 l按以下公式计算各化合物对同位素配基结 合的抑制率百分率： l抑制率(I %)=（总结合管cpm化合物cpm）/ （总结合管cpm非特异结合管cpm）100% l化合物每次实验做两复管，进行两次单独 实验。 8、各种指标 lIC50：半数抑制浓度 lKD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为 受体有一半结合配基时所需要的配基浓度 。 lBmax：受体最大结合容量（fmol /mg蛋白 质） lnH：Hill
9、系数 Scatchard方程与作图 （饱和实验） Scatchard方程与作图 l简单单位点系统受体和配体结合反应（Clark模型） 条件： l（1）配基与受体结合反应为可逆双分子反应； l（2）所有受体都是等效和独立的，同一受体的不 同分子对配基的亲和力都相等，而且不受邻近受体 分子结合配基与否的影响； l（3）配体本身不代谢，也不与其它位置结合； l（4）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。 饱和曲线 l固定的受体数量，固定数量的非标和不同 浓度体积的放射性配体 饱和曲线(saturation curve) 1）饱和曲线 受体数量一定，当配体（一般是不同浓度体积的放射 性配体与固定数量的
10、非标）的浓度从零开始上升时，形成 的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反 应，因此RL（受体配体复合物）的增加不是直线上升， 而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体 结合时，RL的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经 饱和了，此即饱和曲线 。 #饱和曲线的作用？Scatchard作图，求得KD与Bmax 2）曲线的高度取决于RT。在曲线起始段，曲线上升的 快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，KD 越小 (亲和力越大)，饱和曲线上升越快，KD越大 (亲和 力越小)，饱和曲线上升越慢。 （即：亲和力越大，受体 与配件结合速度越快，时间越短） k1, v1 R+L
11、 RL k2, v2 KDK2/ K1=RL/RL 饱和曲线的形状和KD有关（如图1）。 图1 KD对饱和曲线的影响 饱和曲线曲线的高度取决于RT（如图2）。 图2 RT对饱和曲线影响 质量作用定律 (Mass action law)： 受体和配基的结合反应服从可逆反应的质 量作用定律，可用下式表示: k1, v1 R+L RL （1） k2, v2 上式中，R和L 为游离受体和游离配基的浓度，RL为复合物 浓度，v1和v2为结合速率和解离速率，k1和k2为结合速率常数 (association rate constant) 和解离速率常数 (dissociation rate constan
12、t)。 数学表达 l根据质量作用定律： v1 = k1 R L ；v2 = k2 RL l当反应达到平衡后， v1 = v2 , 即: k1 RL = k2 RL ,则 l平衡解离常数（KD）的数学表达式为： KDK2/ K1=RL/RL （2） Scatchard作图 l设LT为配体的初始浓度，RT为受体的初始浓度（即受体总量），则有： L = LT RL R = RT RL 由式（2）整理可得： KD RT-RLL RL 将上式整理可得： RL = RT 1_ RL （ Scatchard 方程） L KD KD 变形：RL为受体与配基特异结合的量，换成B表示，L为自由配基的量，换成F表示
13、 ，RT为受体总量，也即受体最大结合量，换成Bmax表示，则上式方程变为 B/F=Bmax/KD - B/KD （ RT 为受体总量，等于R和RL之和，也是最大结合量Bmax） 以复合物浓度RL为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值RL/L为纵坐 标作图，即为Scatchard作图。 图3 简单单位点系统RBA的Scatchard作图 简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜率为 -（1/KD）， 横轴截距为RT，纵轴截距为RT/ KD（见图3）。 由此求得KD与Bmax Hill方程与作图 l当一个受体分子可以结合一个以上的配基时，配基受体结合反应不是 简单的双分子反应，而是
14、k1, v1 R+nL nRL ，根据质量作用定律推导出Hill方程 ： k2, v2 经过变形得 其中n为hill系数，以结合分数 B/Bmax对游离配基L作图，得 Hill作图（如右）。 （3） l将（3）式两边取对数 非特异性结合 (non-specific binding，NSB) NSB 在RBA系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与 其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。 NSB的特点 亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配 体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见 图4）。 图4 饱和曲线实验中TB、SB和NSB的关系 在RBA的数据处
15、理时，测得的总结合的放射性(total binding，TB)， 必须减去NSB，才能得到特异性结合(specific binding，SB)的数据。 竞争曲线 l固定的放射性配基浓度，一定量的受体和 不同浓度的未标记化合物 数学表达 l此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受 体的能力。通常用IC50和Ki来表示。 闪烁液 l包括溶剂、闪烁剂和添加 剂 l溶剂：溶解闪烁剂和放射 性样品，吸收和传递射线 能量。 l闪烁剂：第一闪烁剂（吸 收受激溶剂能量，退激发 光）、第二闪烁剂（波长 转移，匹配光电倍增管光 谱；提高淬灭耐受） l添加剂：助溶剂、抗淬灭 剂 各受体的非标与同位素 受体
16、非标放射性配基受体组织 5-HT1A 5-HT (serotonin) 3H-8-OH-DPAT 大鼠纹状体/皮层 5-HT2AMethysergide 3H-Ketanserin 大鼠纹状体/皮层 D2Butaclamol 3H-Spiperone 大鼠纹状体 1Prazosin 3H-prazosin 大鼠皮层 2Rauwolscine 3H-Rauwolscine 大鼠皮层 M阿托品 3H-QNB（毕兹 ） 大鼠脑去小脑/回肠 心得舒 3H-DHA 鸭红细 胞/大鼠脑 RBA的安全问题 射线 放射型物质发出的射线有三种： 天然放射现象天然放射现象 三种射线 l射线 l射线 l射线 射线 l 根据射线的偏转方向和磁场方向
