基因治疗2

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1、基因治疗与基因工程 基因治疗（Gene therapy ） 基因治疗基因治疗：指应用DNA重组技术，将外源正常基因 外源正常基因导 入靶细胞靶细胞，以纠正纠正或补偿补偿因基因缺陷和异常引起的 疾病,以达到治疗的目的。 1966年：安德森提出“基因治疗”概念。 1970年：美国医生罗杰斯尝试基因治疗精氨酸血症。 1980年：美国加州大学马丁克赖恩教授进行人类第 一例真正意义上的基因治疗，未获批准，也未获成功 。马丁克赖恩教授被誉为“基因治疗的先驱”。 1989年：美国批准进行5例标志基因的人体转移试验 。安德森被誉为“基因治疗之父”。 1990年：布利等人进行了世界上首次人体基因治疗的 临床试验

2、，取得初步治疗效果。 1991年起：国内外基因治疗临床试验越来越多。 二、基因治疗的发展历史 1990年，布利和安德森等人进行了世界上首次人体基因 治疗的临床试验，他们用无害的病毒作为载体，将能产生 腺苷脱氨酶（ADA）的健康基因导入患者体内的细胞中，用 于治疗由于基因缺陷而无法合成具有分解氨基毒素功能的 ADA的4岁女孩，获得了初步治疗果。 1990-1994年，40余项基因治疗方案被批准；至1998年，已实 施373个临床方案，3134人接受了基因转移试验（其中肿瘤方案 234个，受试者2134人）；至2002年，400余项基因治疗方案进 入临床试验；2003年，基因治疗药物上市。 重点：

3、遗传病（如血友病、地贫、囊性纤维病、家族 性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染 性疾病（如艾滋病、类风湿等），而且以恶性肿瘤为 基因治疗研究的重点对象。 欧盟委员会（EC）已批准了西方世界首个基因治疗药 物Glybera，该药来自一个很小的荷兰生物技术公司 uniQure，标志着修复基因缺陷的新颖医疗技术的一 个里程碑。该药用于治疗一种极其罕见的遗传性疾病 脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD），预计每名患者的 花费将高达120万欧元（约合160万美元），该药将创 造昂贵现代医药的新纪录 1、致病基因的原位置换 2、基因的异位替代 3、直接抑制有害基因的表达 4、增强机体免疫能力的基因治疗

4、第一节、基因治疗的策略 具体策略： 1、基因矫正：对异常基因在原位进行修复，理论上的 理想方式。 2、基因置换：同源重组的方式将正常基因取代变异基 因，困难在于体内同源重组的频率很低 3、基因增补：将正常的目的基因输入病人体内，以补 偿缺陷基因的功能或调整细胞的某些功能 4、基因失活：反义核酸、核酶、DNA三链技术、 RNA干涉和基因敲除（gene knock-out） 5、免疫基因疗法：DNA疫苗，免疫因子基因导入 6、活化前体药物基因疗法 （“自杀基因” ）：如 单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK），催化核苷酸类 似物(丙氧鸟苷)磷酸化为有毒中间物，阻断DNA合 成 7、化疗保护性基因疗法

5、：多药抗性基因（MDR-1） 导入骨髓干细胞 （一）基因置换（gene replacement） 定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通 过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有 的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行矫正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复 ，不涉及基因组的任何改变。 技术：基因同源重组 基因置换必要条件： 1、对导入的基因及其产物有详尽的了解 2、外来基因能有效地导入靶细胞 3、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在 4、导入基因能有适度水平的表达 5、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害 （二） 基因添加 基因添加或称基因增补（gene augmenta

6、tion）: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的 基因。 类型: 1、在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因 ，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正 常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； 2、向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因， 利用其表达产物达到治疗疾病的目的。 基因干预(gene interference) 指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或 者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治 疗疾病的目的。 1. 反义核酸： 封闭基因表达 2. 核 酶： 裂解特异的靶mRNA 3. RNA干涉技术： （三）基因干预 （四）自杀基因治疗 自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一

7、。 原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码 的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物 ，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤 细胞的目的。 自杀基因的作用机制 TK/GCV 单纯疱疹病毒 型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激 酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者 能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。 CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶 （5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）

8、。 1.自杀基因系统 5-FU通过竞争性抑制胸苷酸合酶的活性，从而抑制脱 氧胸苷三磷酸的合成。 旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自 杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与 其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀 死。 2. 旁观者效应 （五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿 瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。 治疗性基因的选择治疗性基因的选择 基因载体的选择基因载体的选择 靶细胞的选择靶细胞的选择 基因转移基因转移 外源基因表达的筛选外源基因表达的筛选 回输体内回输体内 二、基因治疗的基本程序 治疗性基因的选择 目的基因分类： 直接选择缺陷基因

9、的正常基因，如选择腺苷脱氨酶治 疗重症联合免疫缺陷综合征（SCID） 间接治疗作用的基因：细胞因子基因、自杀基因、多 药抗性基因等 目的基因来源： 基因克隆、人工合成和PCR扩增 性细胞基因治疗（Germline gene therapy）:是在 生殖细胞中进行操作，改变生殖细胞的程序，这 些细胞能将改变传递给下一代，使其后代从此再 不会得这种遗传疾病。 伦理学问题？ 体细胞基因治疗（Somatic gene therapy）:是在体 细胞中进行基因操作，以改变身体已分化细胞 DNA的程序，但这些细胞没有能力将这种改变传 递给下一代，其子孙后代仍会患这种病。 二、靶细胞的选择二、靶细胞的选择

10、靶细胞的选择须考虑： 1.最好为组织特异性细胞 2.细胞较易获得，且生命周期较长 3.离体细胞较易受外源基因转化 4.离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍 较易成活 目前常用的靶细胞有： 1.造血细胞 2.皮肤成纤维细胞 3.肝细胞 4.血管内皮细胞 5.淋巴细胞 6.肌肉细胞 7.肿瘤细胞 三）靶细胞的选择 靶细胞是指接受外源Gene的体细胞 选择靶细胞的原则是： 1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术 操作； 2）易于由人体分离又便于输回体内 3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至 几年，或整个生命周期） 4）易于受外源遗传物质转化。 常见的靶细胞 外周血T淋巴细胞 上皮细

11、胞 内皮 皮肤成纤维细胞 造血干细胞地中海贫血、严重 复合免疫缺陷病等基因治疗 肝C家族性高胆固醇血症、低密度 脂蛋白病的基因治疗 肌细胞 人类体细胞基因治疗方法: 体外法（ex vivo）：将病人的细胞取出，在体外加入正常基因 校正细胞，再将校正后的细胞放回到病人体内，使新的功能 得到表达。 原位法（in situ）：将新基因直接引入病人疾病部位（如癌块 、心肌等），可用病毒宿主或裸露的DNA引入。 体内法（in vivo）：将宿主注入血流，将治疗性基因以安全有 效的方式带至组织，目前尚未研制成功。 生物学方法（病毒载体） 逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病 毒载体，单纯疱疹病毒载体

12、非生物学方法 物理方法：显微注射，电穿孔 化学方法：脂质体，磷酸钙共沉淀，其它方法 三、基因治疗中基因导入的方法 1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是 使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实 验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多 的是逆转录病毒载体。 感染细胞 Retrovirus （1）逆转录病毒 主要有逆转录病毒（Retrovirus, RV）、慢病毒 （Lentivirus, LV）、腺病毒（Adenovirus, AV）、 腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）等。 LTRLTRgaggagpolpo

13、lenvenvLTRLTR 长末端长末端 重复序列重复序列 调节和调节和 启动转录启动转录 产生病毒产生病毒 核心蛋白核心蛋白 产生产生 逆转录酶逆转录酶 产生病毒产生病毒 外膜蛋白外膜蛋白 包装信号包装信号 DNADNA前病毒的结构特征前病毒的结构特征 U5 R U3U5 R U3 U3=U3=增强子，增强子，R=R=启动子，启动子，U5=U5=转录起始位点转录起始位点 (1)保留病毒颗粒的包装信号而缺失病毒蛋白基因 (2) 辅助细胞株，产生病毒包装蛋白。 包装细胞主要有： 2 PA317 CRIP Retroviral packaging system 逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒包膜

14、上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动 物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的 遗传物质高效地进入靶细胞。 逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分 的活性。 前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因 在靶细胞中的永久表达。 包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载 体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于 分离制备。 逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜 在危险； 逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。 （2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)

15、双链无包膜DNA病毒。它 通过受体介导的内吞作用进入细胞内，腺病毒基因组转移 至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因 组中。 AV两端各有一个反向重复序列目前作为基因治疗中所 用的AV载体通常是一些复制缺陷病毒，其基因缺失位于基 因组的E1A-E1B或E3区。 ITRITRE2E3E3E4E4E1E1ITRITR 反向重复序列 包装信号包装信号 腺病毒的优点 1.基因导入效率高，对人类安全； 2.宿主范围广； 3.基因转导与细胞分裂无关； 4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸 入或气管内滴注； 5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因 ； 腺病毒载体缺点 2.宿主

16、的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。 4.靶向性差（特异性差）。 1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快 的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的 机会增多，表达时间相对较短。 (1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同 源重组； (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺 病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。 2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后 ，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞 一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目 的基因）转移至细胞内，并进行表达。 脂质体介导的基因转移示意图 人工脂质体膜具有如下特点： 1.与体细胞相容，无毒性和免疫原性 2.可生物降解，不会在体内堆积 3.可制成球状(0.035