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1、南昌大学医学院 硕士学位论文 三氧化二砷对人胆管癌细胞侵袭转移能力的影响及机制 姓名：李光明 申请学位级别：硕士 专业：外科学（肝胆外科） 指导教师：黄长文 20100601 摘要 M 舳 Y 17 4 6 1 4 5 ” 摘要 目的： 通过探讨三氧化二砷( A s 2 0 3 ) 对人胆管癌细胞系Q B C 9 3 9 异质黏附力、侵 袭穿膜能力及侵袭相关基因尿激酶型纤溶酶原激活因子( u P A ) 、基质金属蛋白酶 9 ( M M P 一9 ) 表达的影响，为胆管癌的治疗提供理论依据。 方法： 1 、常规培养人胆管癌细胞系Q B C 9 3 9 。实验组加入4 p m o l L 的A
2、s 2 0 3 ( 预 实验筛选出的有效浓度为4 p m o l L ) ，对照组加等体积R P M I 一1 6 4 0 液，另设空白 对照组。3 7 。C 培养7 2h ( 预实验筛选出的有效培养时间为7 2 h ) ，培养结束后分 别于不同时问点( 3 0 m i n 、6 0r a i n 、9 0m i n 、1 2 0r a i n ) 采用M T T 法检测胆管癌 细胞异质黏附能力。 2 、将对照组细胞( 只加入R P M I 1 6 4 0 培养液) 及不同浓度A s 2 0 3 组细胞( 1 、 2 、4 、8 9 m o l L ) 分别接种于T r a n s w e l
3、 l 趋化小室，培养7 2 h 后，检测胆管癌细胞 侵袋穿膜能力。 3 、以不同浓度A s 2 0 3 ( 1 、2 、4 、8 p m o l L ) 作用胆管癌细胞7 2 h ，4 9 m o l L A s 2 0 3 作用( 2 4 、4 8 、7 2 、9 6h ) 不同时间后，R T - P C R 方法检测u P A 、M M P 9 m R N A 在胆管癌细胞中表达的变化。 结果： 1 、经4 9 m o l L A s 2 0 3 预处理人胆管癌细胞7 2 h 后，实验组肿瘤细胞3 0 、6 0 、 9 0 、1 2 0r a i n 时黏附率分别为8 2 4 、7 9 、
4、7 5 2 、7 1 4 ，以1 2 0 分钟时黏附 率最低( 7 1 4 ) ，各实验组与相应对照组的1 0 0 相比，户均 0 0 5 ) 。 2 、经2 、4 、8 9 m o l L 的A s 2 0 3 作, t N 7 2 h 后，Q B C 9 3 9 穿膜细胞数分别为( 7 0 土9 ) 、 ( 3 7 士6 ) 、( 2 1 土4 ) 个。各组与对照组的( 9 7 士7 ) 个相比，均 0 0 5 ) ，各组间比较妒 0 0 5 ) ，参与对照组比较( 尸 0 0 5 ) ，随着作用时间的延长u P A 的表达逐渐下降。因此我 们认为A s 2 0 3 可呈时间剂量依赖性抑制
5、胆管癌细胞u P A 的表达。本实验发现， 随A s 2 0 3 剂量增加穿越m a t r i g e l 的Q B C 9 3 9 细胞数而不断减少，体外侵袭能力 下降，代表侵袭能力的u P A 表达量也逐渐下降。我们推测，A s 2 0 3 通过抑制u P A 表达，阻止肿瘤细胞对基底膜的降解从而影响细胞的浸涧和转移。 M M P 9 为基质金属蛋白酶家族中重要的一员，大量研究表明M M P 9 在多 种肿瘤组织中呈现过表达，其在恶性肿瘤的浸润转移中扮演重要角色t 6 3 , 6 4 1 。 M M P 9 在肘，瘤细胞侵袭过程中的作用主要通过：( 1 ) 溶解破坏B M 和E C M
6、所 构成的物理屏障；( 2 ) 活化的M M P 9 可使其它M M P s 活化，形成级联反应( 3 ) M M P 9 可调节细胞问粘附力，促进肿瘤细胞向周围生长；( 4 ) M M P 9 可促进 肿瘤新I 血管的形成【6 川。IV 型胶原是基膜的主要支架。肿瘤细胞分泌的M M P 9 能溶解基膜中的IV 型胶原、明胶、层黏蛋白和E C M ，导致肿瘤的浸润和转移 【6 6 l 。实验证明转移性癌细胞株基质金属蛋白酶一9 活性比非转移性癌细胞株更强， 表明其在促进癌细胞侵袭转移中起重要作用。杨定忠等报道5 5 例胆管癌中基质 金属蛋白酶9 阳性表达率为7 6 4 ，显著高于正常胆管组织(
7、 1 6 7 ) ，且有淋 2 0 第4 章讨论 巴结转移组显著高于淋巴结未转移组【6 刀。M o n 等研究发现M M P 。9 的大量激活在 胆管癌的侵袭中发挥了至关重要的作用1 6 引。A n t e b y 等发现M M P s 除了可以裂 解E C M 和B M 外，还可以刺激分泌V E G F 、E G F 等促血管生成因子，并且与V E G F 在肿瘤的新生血管生成及肿瘤的生长中发挥着相互促进的作用【6 9 K i r i m l i o 莒l u 等 研究发现在伴神经侵袭的8 例肝门胆管癌和8 例远端胆管癌中M M P 9a n d M M P 一1 4 均高表达，认为其在神经
8、侵袭中具有重要作用1 70 | 。由此可见M M P 一9 是 胆管癌侵袭转移的重要因子。在本实验中，小剂量( 1 1 t m o l L ) 三氧化二砷短时 间( 2 4 h ) 作用胆管癌癌细胞后，胆管癌细胞M M P 9 基因的表达未见明显下降， 与u p a 相同，A s 2 0 3 呈时间剂量依赖性抑制M M P 9 基因的表达。 综上所述，本实验初步证明三氧化二砷具有抑制胆管癌细胞体外侵袭的作 用。并且对胆管癌痛细胞u p a 、M M P 9 基因的表达有明显的抑制作用，且这种 抑制作用存在时间剂量依赖性。我们认为这可能是三氧化二砷抑制胆管癌细胞 侵袭转移的机制之一。 2 1 第
9、5 章小结 第5 章结论 本实验旨在研究三氧化二砷对人胆管癌胞株Q B C 9 3 9 黏附，侵袭能力的影 响，及对侵袭转移相关基因u P A 、M M P 9 表达的影响并初步探讨其可能的机制。 1 、一定浓度的三氧化二砷( 4 “t o o l L ) 能抑制人胆管癌胞株Q B C 9 3 9 的异 质黏附能力。 2 、一定浓度的三氧化二砷能抑制人胆管癌胞株Q B C 9 3 9 的侵袭穿膜能力， 其抑制作用呈剂量依赖性。 3 、三氧化二砷能抑制人胆管癌胞株Q B C 9 3 9 侵袭转移相关基因u P A 、M M P 9 表达，其抑制作用呈时问剂量依赖性。以4 “m o l L 作用7
10、 2 h 后抑制最为明显。 上述研究证明表明三氧化s i r t , 可以从黏附、运动和侵袭等环节抑制人胆管 癌胞株Q B C 9 3 9 细胞的体外侵袭能力，其机制可能与抑制胆管癌细胞u P A 、 M M P 9 表达有关。 展望： 胆管癌侵润转移过程是多基因调节的复杂过程，本研究仅涉及u P A 、M M P 9 两个转移相关基因，对三氧化二砷抑制胆管痛细胞黏附、侵袭的具体细胞信号 转导机制还需进一步研究。此外，本研究也仅涉及三氧化二砷的体外研究，而 三氧化二砷应用到临床治疗胆管癌还需进一步的体内实验及临床试验研究。 致谢 致谢 时光流逝，转眼三年已经过去，伴随着我的研究论文的撰写完成，
11、三年的 研究生学习生活即将结束。在这三年中，我得到了来自老师、同学、朋友及家 人无私关怀及不断的支持和鼓励，让我一生难于忘怀，借此机会，特向他们表 达我最真诚的谢意! 本研究从选题、设计、实验到论文的撰写均得到了导师黄长文副教授的悉 心指导，凝聚了他大量的心血。三年中，黄老师渊博的学术知识，严谨求实的治学 态度及宽容豁达的为人之道深深影响了我，让我一步步对科研产生了浓厚的兴 趣，对枯燥的分子生物学有了全新的认识，这些都让我受益匪浅。在此向我的 老师：黄长文副教授，深深地鞠躬，表达我的由衷的感谢和崇高的敬意! 感谢南昌大学二附院傅华群教授、邵江华教授、邹书兵教授、邬林泉教授 及其他研究生指导小组
12、成员的指导。对江西省重点实验室二附院分子医学中心 徐艳萍老师、尹东老师、蒋建红老师的帮助表示感谢。 感谢我的师兄蔡成行、马景胜、刘天德，研究生同学黄龙璋、王开阳等在 课题研究中的辛勤劳动和无私帮助! 最后对我的父母、及全家表达我诚挚的感谢，感谢多年来您们对我的支持 和帮助，我一定会继续努力，不辜负导师、亲人、各位老师、同学、朋友对我 的期望，在未来的工作和学习中取得更大成就! 李光明 2 0 10 年6 月 参考文献 参考文献 1 】l s o m o t oH E p i g e n e t i ca l t e r a t i o n sa s s o c i a t e dw i t h
13、c h o I a n g i o c a r c i n o m a ( r e v i e w ) O n c o iR e p 2 0 0 9 ，2 2 ( 2 ) ：2 2 7 - 3 2 2 】S a k a m o t oE ，N i m u r aYH a y a k a w aN ，e ta 1 T h ep a t t e mo fi n f i l t r a t i o na tt h ep r o x i m a l b o r d e ro fh i l a rb i l ed u c tc a r c i n o m a ：Ah i s t o l o g i c
14、a la n a l y s i so f6 2r e s e c t e dc a s e s 【J 】A n n S u r g ，1 9 9 8 ，2 7 7 ( 3 ) ：4 0 5 1 1 【3 】N a k e e bA ，P i t tH A ，S o h nT Ae ta 1 C h o l a n g i o c a r c i n o m a As p e c t r u mo fi n t r a h e p a t i c ，p e r i h i l a r ， a n dd i s t a lt u m o r s A n nS u r g ，19 9 6 ，2 2
15、 4 ( 4 ) ：4 6 3 _ 4 7 3 【4 】黄志强，当今_ l j 日道外科的发展与方向。中华外科杂：基，2 0 0 6 ，4 4 ( 2 3 ) ：1 5 8 5 - 1 5 8 6 【5 】P a r k e rS L ，T o n gT B o l d e nS ，e ta 1 C a n c e rs t a t i s t i c s ，l9 9 6 J C A C a n c e rJ C l i n ，l9 9 6 ，4 6 ( 1 ) ：5 - 2 7 【6 】6 A n n eD e m o l s ，R a p h a e lM a r 6 c h a l ，J
16、 a c q u e sD e v i 6 r e ，J e a n L u cV a nL a e t h e m B i l i a r yt r a c t c a n c e r s ：F r o mp a t h o g e n e s i st oe n d o s c o p i ct r e a t m e n t 。B e s tP r a c t i c e & R e s e a r c hC l i n i c a l G a s t r o e n t e r o l o g y , 2 0 0 7 ，2 l ( 6 ) ：1 0 1 5 - 1 0 2 9 【7 】7 P a t e lT ，S i n g hP C h o l a n g i o c a r c i n o m a ：e m e r g i n ga p p r o a c
