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1、第二军医大学 硕士学位论文 Annexin A1的表达与大肠癌转移侵袭的关系 姓名：葛慧娟 申请学位级别：硕士 专业：病理学与病理生理学 指导教师：余宏宇 20100501 A n n e x i n A l 的表达与大肠癌发展和转移的关系 摘要 研究背景： 大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，具有高复发和高转移的特点。其5 年总体生存 率在6 0 左右，近年来发病率逐步上升，严重危害人民生活健康。目前对于大肠癌的 发病及其转移尚无有效的防治手段，其发病机制和防治依然是这一领域中的研究热 点。 A n xA I 是钙磷脂结合蛋白A n x 超家族的成员之一，在信号传导、D N A 复制、细胞 周期调
2、控、细胞转化、细胞凋亡、钙离子通道的形成等众多的生理过程中发挥重要作 用。众多的研究己经证实了A n x A l 与多种肿瘤的发生关系密切，其表达在多个系统 的肿瘤中明显异常，直接或间接参与肿瘤的发生。 研究目的： 本研究旨在应用免疫组化、荧光定量R T - P C R 和W e s t e m b l o t 方法检测癌周正常粘 膜组织、大肠癌癌前病变( 管状绒毛状腺瘤) 、A n xA 1 在不同分化水平的大肠癌及 大肠癌淋巴结转移灶中的的表达水平，以期探讨A n xA I 的表达水平与大肠癌的发生、 发展和转移之间的关系。 研究方法： 收集2 0 例大肠癌及1 0 例管状绒毛状腺瘤新鲜标
3、本，采用免疫组化S P 法、荧光定量 R T - P C R 和w e s t e r nb l o t 方法检澳t A n xA 1 在m R N A 及蛋白水平的表达。进一步收集大肠 癌石蜡包埋组织块3 0 例，采用免疫组化S P 法，检：i 贝! l A n xA 1 在大肠癌正常粘膜、管状 绒毛状腺瘤中、不同分化程度的大肠癌以及同一标本的原发灶与淋巴结转移灶中的 A n xA 1 的表达水平。S P S S 统计学软件进行数据处理与统计学分析。 研究结果： 一、免疫组化和W e s t e r n b l o t 检；澳l J A n x A l 蛋白在正常大肠黏膜、管状绒毛状腺瘤、大
4、肠 癌及其淋巴结转移癌灶中的表达及临床意义 A n x A l 在肠道上皮细胞中主要定位于细胞胞浆中。腺瘤、腺癌及癌周正常组织 均有不同程度的阳性表达，呈淡黄色、棕黄色或者棕褐色颗粒。腺癌，腺瘤及正常粘 膜3 组A n x A l 表达差异具有显著性( H = 1 6 9 1 3 ，P = 0 0 0 0 9 5 ) ：癌组织由大小不一的腺管构成，癌细胞分 化较好，呈柱状，单层排列，核多位于基底部，可出现散在的杯状细胞。 2 级，中分化腺癌( 腺管状结构5 0 9 5 ) ：癌细胞分化较差，大小甚不一致，呈 假复层排列，细胞核大，位置参差不齐，常达胞浆顶端，胞浆少，不能见到胞浆带， 癌细胞构成
5、大小不一、形态不规则之腺管。 3 级，低分化腺癌( 腺管状结构5 0 0 5 ) ，这与第一部分免疫组化结果不完全一致。 从表l 和图1 中可以直观的看出，A n x A lm R N A 在正常粘膜中表达较高，在腺瘤 和腺癌标本中不同程度的表达下调，而且不同分化水平的腺癌中A n x A lm R N A 表达 水平也不相同，提示m R N A 表达水平下调与大肠癌的发生和肿瘤分化程度密切相关， 分化越好，表达率越高：在腺瘤中A n x A lm R N A 表达开始下调，与腺癌中表达水平 相似，提示A n x A lm R N A 的表达水平在腺瘤中己发生改变，进一步说明其参与了肿 瘤的发
6、生。 A n n e x i n A l 的表达与大肠癌发展和转移的关系 表1A n x A Im R N A 在各组织中的表达量 1O 8 9 1 2 3O 7 3 O 5 2 O 5 8 O 7 2 0 5 8 O 6 9 O 5 7 1 6 7 1 1 2 0 6 5 0 6 7 O 7 1 0 8 6 0 8 0 5 3 O 3 5 O 8 3 1 2 2 0 4 2 1 2 6 O 4 7 0 5 8 1 O l O 6 4 o 1 4 O 5 6 O 6 6 2 6 82 3 6 0 2 23 5 2 2 0 21 9 8 2 7 61 7 5 2 2 92 3 2 1 61 8
7、3 1 8 61 9 1 1 2 82 2 9 2 4 42 1 2 0 6 21 3 8 图1A n x A lm R N A 组织表达量 此图为表1 的柱状图，图中直观显示3 组标本中A n x A lm R N A 的表达水平，正常粘 膜中高表达，在腺瘤及腺癌中表达下调。 3 1 第二军医大学硕士学位论文 讨论 荧光定I R T - P C R ( F QR T - P C R ) 是目前检测低浓度m R N A 最敏感方法。它以宽动力 学范围、高敏感性、高准确性、高通量以及无P C R 后处理等优点而在临床诊断和科学 研究中广泛应用。目前最简单、经济、有效的F QR T - P C R
8、 方法是通过嵌入双链 D N A ( d s D N A s ) 的荧光试剂，如S ；RG r e e nI 等来检i 9 l I J P C R 扩增产物。在P C R 的延伸阶 段，S Y B RG r e e nl 与d s D N A s 相结合而发出荧光，随着反应的进行，荧光信号逐渐增 强。荧光信号的强度依赖于反应体系中现有的d s D N A s ( 包括特异性扩增产物和引物二 聚体等) 的量。 F QR T - P C R 中，为了去除不同标本在R N A 的产量、质量以及逆转录效率上可能存 在的差别而获得真正的目标基因特异性表达的差异，通常选择合适的的内参基因进行 校正和标准化
9、，这是实验结果可靠与否的关键。理想的内参基因应该满足以下条件f l 】： 不存在假基因，以避免基因组D N A 的扩增；高度或中度表达，排除太高或低表 达：稳定表达于不同类型的细胞和组织( 如正常细胞和癌细胞) ，而且其表达量是近 似的，无显著差别；表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；其稳定的表达 水平与目标基因相似；不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理 措施的调节或影响。适合于实时P C R 反应内标基因包括G A P D H ，1 3 a c t i n ，f 1 2 m i c r o g l o b u l i n 以及r R N A 。因此，本研究中我们应用G A
10、 P D H 进行校正和标准化，从而 获得A n x A lm R N A 特异性表达的结果。 为了定量和比较的方便，在实时荧光定量P C R 技术中引入了两个非常重要的概 念：荧光阈值和C T 值。荧光阂值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设 定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3 1 5 个 循环的荧光信号的标准偏差的1 0 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经 历的循环数被称为C T 值( c y c l et h r e s h o l d ) C T 值与起始模板的关系研究表明，每个 模板的C T 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性
11、关系，起始拷贝数越多，C T 值越 小。利用己知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对 数，纵坐标代表C T 值。因此，只要获得未知样品的C T 值，即可从标准曲线上计算出 该样品的起始拷贝数。 现在最常用的两种分析实时定量P C R 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。 绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样 品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2 一A A C T 方法是实时定量P C R 实验 中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。使用内参基 因的目的是为了对加入到反转录反应中的R N A 进行
12、均一化处理。 A n n e x i n A l 的表达与大肠癌发展和转移的关系 现在有越来越多的证据提示A n x A l 参与了肿瘤的发生，并且与肿瘤的转移与侵 袭相关1 2 - $ 。第一部分的免疫组化结果也证明了A n x A l 的表达可能与肿瘤的发生、侵 袭与转移有关。这一部分F QP R P C R 的实验结果进一步验证了我们之前的结论。在 转录水平：正常组2 0 例均不同程度表达A n x A lm R N A ，大肠癌组和癌前病变腺瘤组 中m R N A 表达水平较正常粘膜中显著下调，分化不同的腺癌中A n x A lm R N A 表达水 平也不相同，肿瘤分化越好，其表达量
13、越接近正常粘膜，提示m R N A 表达水平可能 与大肠癌分化程度相关。我们得出的这一结论与很多报道相符，A n d r e w 脯【7 】运用组 织芯片( t i s s u em i e m a r r a ya n a l y s i s ，T M a ) 对2 3 例良性前列腺上皮( b e n i g np r o s t a t i c e p i t h e l i u m ，B P E ) ，2 3 例雄激素刺激性前列腺癌( a n d r o g e ns t i m u l a t e dp r o s t a t e ，A S C a P ) 和2 5 例复发性前列腺癌(
14、 r e c u r r e n tp r o s t a t ec a n c e r ，R C a P ) A n x A l 的表达进行分析发 现，A S C a P 、R C a P 中A n x A l 均较B P E 下调表达。其中，复发性前列腺癌的A n x A l 平均光密度值( m e a no p t i c a ld e n s i t y ，M O D ) 比雄激素刺激性前列腺癌低5 0 。说明A n x A l 在肿瘤的发生发展中起关键作用。S h e n 等【8 】运用T M A 对3 1 4 例正常乳腺组织，1 7 5 例侵袭性乳腺癌进行分析发现，侵袭性导管癌和原
15、位导管癌中腺癌细胞A n xA I 明显 较正常乳腺组织腺细胞低表达。此外，A n xA I 在正常乳腺组织中的肌上皮细胞内高 表达，但在原位导管癌中，肌上皮细胞A n xA I 明显低表达，说明A n xA 1 的表达与 乳腺癌发生、发展与分化密切相关。 从结果部分的表2 中可以直观的看出，A n x A lm R N A 的表达水平在大肠腺瘤中 已经开始不同程度的表达下调，结合第一部分免疫组化结果中A n x A l 蛋白在腺瘤水 平也有不同程度的表达上调，说明A n x A l 表达水平的改变发生于大肠癌形成之前。 M a s a k i 等【6 】发现，在转录和翻译水平肝癌细胞较正常肝
16、组织和慢性肝炎组织均显示 A n x A l 的过表达，且其表达水平和组织分化程度呈负相关，低分化区较高分化区高： 而且，还发现癌细胞周围的形态学正常的肝细胞中也存在A j a xA 1 的表达，提示癌变 过程中A n xA 1 的表达异常先于形态学异常出现，是更早期的变化。在头颈鳞状细胞 癌( H N S C C s ) 中，A n x A l 在临近正常组织中( 基底层和基底上层细胞除外) 呈强阳性表 达，而在所有不典型增生组织中表达明显下调，这种表达的下调与上皮分化状态、局 部淋巴结转移程度、组织病理学分级密切相关，恶性程度越高，A n xA 1 表达越低1 9 】 本试验中，正常组表达A n x A lm R N A 表达水平要高于大肠癌组和腺瘤组，这与 之前的免疫组化蛋白表达水平恰好相反。A n x A l 蛋白由其m R N A 转录而成，理论上 蛋白表达水平应与m R N A 水平呈一致性，然而本实验中
