尿激酶联合黄芪对痛风性肾病的影响及机制研究

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1、南方医科大学2 0 0 7 级博士学位论文 尿激酶联合黄芪对痛风性肾病的的影响及机制研究 E f f e c ta n dM e c h a n i s mo fU r o k i n a s ea n dA s t r a g a l u s o nt h eG o u t yN e p h r o p a t h y 课题来源：广东省自然科学基金( 8 1 5 1 0 0 1 0 0 2 0 0 0 0 0 6 ) 专业名称内科学( 内分泌学) 学位申请人 指导教师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 冯烈教授 范冠杰教授 吕雄教授 童俊容主任 高方副教授 论文评阅人范冠杰教授 吕雄教授 杨敏

2、教授 2 0 1 0 年4 月1 0 日广州 I I I l l l l l f lI I I I II I I II l f lI l l l F Y 17 7 0 5 6 2 博士学位论文 尿激酶联合黄芪对痛风性肾病的 影响及机制研究 一、研究背景 博士研究生：罗正茂 导师：薛耀明教授 导师：罗仁教授 中文摘要 痛风性肾病是痛风的严重并发症，预后差，延缓痛风患者的肾功能恶化是 痛风治疗的一个重要环节。痛风性肾病主要表现为肾小管间质的炎症和纤维化， 即肾小管丧失、肾间质炎症细胞聚集、细胞外基质( E x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，E C M ) 积聚

3、、肾小管上皮细胞一间充质细胞转分化( E p i t h e l i a l m e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n ， E M T ) 以及血管壁的增厚、管腔狭窄等。现在已经明确，肾间质纤维化为痛风 性。肾病进展过程中的重要病理特点，且是反映。肾功能和判断预后的重要指标。 其发生机制复杂，参与因素众多。随着其分子机制研究的深入，发现核转录因 子r , B ( n u c l e a rf a c t o rk a p p aB ，N F 1 c B ) 信号通路在痛风性肾病的发生发展过程 中起了重要的作用。 N F r , B 是一种具有多向调控作用

4、的转录因子，在炎症反应网络中发挥重要 作用，它由P 5 0 P 6 5 两个亚单位组成异源二聚体，正常情况下，与其抑制蛋白I r d 3 结合，以无活性的三聚体形式存在于细胞浆中。当肾间质过多的尿酸沉积时， 尿酸通过激活M A P K 通路( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，M A P K ) ，引起细胞 外信号调节激酶( E x t r a c e l l u l a rs i g n a l r e g u l a t e dk i n a s e ，E R K ) 的磷酸化，激活 中文摘要 N F r B ，

5、诱导多种促炎、促纤维化细胞因子生成增多，促使炎症细胞活化，肾小 管上皮细胞受损，导致细胞外基质聚积；同时炎症因子的释放可以激活肾素血 管紧张素系统，导致血管病变和高血压。 在痛风性肾病发展过程中，观察到成纤维细胞的标志蛋白仅平滑肌肌动蛋白 ( 仅S M A ) 增多，表明在肾脏损害过程中出现了E M T 。S n a i l 是具有锌指结构的 转录因子，它通过与上皮钙粘蛋白( E c a d h e r i n ) 启动子区域的E b o x 结合，下调 E c a d h e r i n 的表达，进而诱导上皮细胞E M T 的发生。新近研究发现，N F r , B 激 活可上调S n a i

6、 l 表达，成为细胞炎症反应导致组织纤维化机制研究中的热点。 尿激酶初期被认识具有溶解血栓的作用，并且在临床广泛用于抗凝和溶栓 治疗，疗效佳已得到公认。近年来人们发现尿激酶还具有其它作用，能改善炎 症和脏器纤维化。黄芪是传统中药的一种，性温味甘，具有补气升阳，利水消 肿等功效，在痛风患者出现肾功能损害时，常被联用来健脾补肾，取得良好功 效。因此，我们根据中西医结合理论，在原有尿激酶治疗的基础上，联用黄芪 益气活血，研究尿激酶联合黄芪治疗痛风性肾病的疗效及其作用机制，探寻有 效防治痛风性肾病的策略和手段。 本研究在前期工作基础上，建立环孢素A ( C y c l o s p o r i n e

7、A ，C s A ) 致痛风 性肾病模型，通过观察尿激酶联合黄芪对模型大鼠。肾组织N F r d 3 激活及S n a i l 表达的影响，探讨联合治疗方案对痛风性肾病的治疗作用以及其作用机理。 二、尿激酶联合黄芪对痛风性肾病大鼠的治疗作用 目的：探讨尿激酶联合黄芪对痛风性。肾病大鼠肾间质纤维化的治疗作用。 方法：采用1 2 1 服灌胃C s A ( 2 5 m g k g d ) 致大鼠痛风性。肾病模型，将大鼠随 机分为5 组：对照组( C o n t r o l 组) 、模型组( C s A 组) 、尿激酶组( U P A 组) 、 黄芪组( A M 组) 及联合治疗组( U n i t

8、e 组) ，4 周末取标本( 分别留取血标本和 肾组织标本，组织标本分别送甲醛固定、E D T A 匀浆留取上清冻存和液氮冻存) 。 全自动生化分析仪检测血肌酐( S c r ) 、尿素氮( B U N ) ；H E 染色观察肾脏组织结构 l I 博士学位论文 变化；M a s s o n 染色观察肾间质胶原沉积；应用试剂盒测定肾组织羟脯氨酸的含 量。 结果：1 检测S c r 、B U N 值的结果显示，与C o n t r o l 组比较，C s A 组S c r 、 B U N 值显著增高( P 值分别为P 0 0 1 和P 0 0 5 ) ，U P A 组和U n i t e 组S c

9、 r 、B U N 较C s A 组显著下降( P 值分别为P 0 0 1 和P 0 0 5 ) ，A M 组S c r 较C s A 组显著 下降( P 0 0 5 ) 。2 H E 染色显示，C s A 组大鼠肾小管萎缩或扩张，肾间质宽度增加，。肾间质大量炎症 细胞浸润，U P A 及U n i t e 组肾小管损伤程度较C s A 组显著减轻( P 0 0 5 ) ，且U n i t e 组损伤程度显著低于A M 组( P 0 0 5 ) 。3 M a s s o n 染色结果，C s A 组肾间质出现大量绿色胶原沉 积，治疗各组。肾间质的胶原纤维增生比C s A 组显著减轻( P 0

10、0 5 ) ，U n i t e 组肾 间质胶原沉积在造模各组中最轻，且显著低于A M 组( P 0 0 5 ) 。4 羟脯氨酸 的测定，C o n t r o l 组羟脯氨酸的含量呈基础表达量，C s A 组羟脯氨酸的含量较 C o n t r o l 组显著增加( P 0 0 1 ) ，与C s A 组比较，治疗各组肾组织羟脯氨酸的含量 显著减低( P 0 0 1 ) ，U n i t e 组羟脯氨酸的含量显著低于U P A 组和A M 组( P 0 0 1 ) 。 结论：1 尿激酶联合黄芪能改善大鼠的肾功能。2 尿激酶联合黄芪能减轻 肾间质炎性细胞浸润和。肾小管损伤程度。3 尿激酶联合黄

11、芪能降低肾组织胶原 及羟脯氨酸的含量，从而减轻肾间质纤维化程度。以上结果中，尿激酶联合黄 芪治疗均较二者单一治疗的效果更好。 三、尿激酶联合黄芪对大鼠肾组织N F K B 表达的影响及意义研究 目的：探讨尿激酶联合黄芪对大鼠肾组织N F r , B 表达的影响及意义。 方法：采用免疫荧光、W e s t e r n 印迹检测N F 1 c B 在肾组织中的分布及表达， 并应用W e s t e r n 印迹检测I K B a 和I r , B p 蛋白的降解，采用E L I S A 检测T N F Q 的 含量，从N F r B 激活和I r , B 降解两个方面观察尿激酶联合黄芪对N F r

12、 , B 通路的 调控作用。 I I I 中文摘要 结果：1 免疫荧光结果，C s A 组p - p 6 5 的荧光强度最强，主要表达于肾小 管上皮细胞的胞核内，与C s A 组相比较，U P A 组与U n i t e 组p - p 6 5 的荧光强度 显著减弱( P 0 0 5 ) ，U n i t e 组的荧光强度在治疗组中最低，且显著低于黄芪组 ( P 0 0 5 ) 。2 W e s t e r n 印迹检测 肾组织p - p 6 5 及总的p 6 5 水平，各组总的p 6 5 水平无显著差异；与C o n t r o l 组相 比较，P p 6 5 在C s A 组表达显著增高(

13、P 0 0 5 ) ，治疗各组P p 6 5 表达均显著低 于C s A 组( P 0 0 5 ) ，U n i t e 组P p 6 5 表达与其他治疗组相比显著降低( P 0 0 5 ) 。 3 W e s t e r n 印迹检测I r 。B a 和1 1 c B D 的蛋白水平，与C o n t r o l 组相比较，C s A 组的I r , B a 蛋白显著减少( P O 0 5 ) ，治疗各组的I r B a 均显著高于C s A 组( P O 0 5 ) ，U n i t e 组的I r J 3 a 表达还显著高于其他治疗组( P 0 0 5 ) ； I r _ B 1 3 的

14、降解各组间无显著差 异。4 E L I S A 检测。肾组织T N F 0 【的水平，与C o n t r o l 组相比较，C s A 组T N F a 的含量显著增高( P 0 0 5 ) ，治疗各组与C s A 组相比T N F 0 【的含量显著减低 ( P O 0 5 ) ，U n i t e 组T N F 0 L 的含量降至最低，且显著低于黄芪组( P O 0 5 ) 。 结论：1 尿激酶联合黄芪能抑制肾组织内p 6 5 发生磷酸化，从而减少p 6 5 的核转位发生。2 尿激酶联合黄芪能降低肾组织P p 6 5 的表达。3 尿激酶联合 黄芪能抑制肾组织的I r B a 的降解，从而抑

15、制N F K B 的激活。但对I r B 3 的降解 无影响。4 尿激酶联合黄芪能减少。肾组织T N F Q 的含量，从而减轻。肾间质的炎 症反应程度。以上结果中，尿激酶联合黄芪治疗均较二者单一治疗的效果更好。 四、尿激酶联合黄芪对大鼠肾组织s n a i l 表达的影响及意义研究 目的：探讨尿激酶联合黄芪对大鼠肾组织s n a i l 表达的影响及意义。 方法：应用免疫组织化学染色法观察S n a i l 蛋白的表达及分布，采用R T - P C R 、 W e s t e r n 印迹检测S n a i l 的m R N A 与蛋白的表达水平，并检测S n a i l 与E M T 标志

16、蛋白：肾小管上皮细胞标志蛋白E c a d h e r i n 和成纤维细胞标志蛋白F S P l 。 结果：1 免疫组织化学结果：C o n t r o l 组S n a i l 表达的量很少。C s A 组肾小 管上皮细胞、肾小球脏层上皮细胞均表达S n a i l ，且多位于细胞核内，表达的量 I V 博士学位论文 较对照组显著增加( P 0 0 5 ) ，治疗各组的S n a i l 蛋白表达均显著低于C s A 组 ( P 0 0 5 ) ，且U n i t e 组S n a i l 蛋白表达显著低于U P A 组和A M 组( P 均 O 0 5 ) 。 2 R T - P C R 检测肾组织S n a i lm R N A 的表达，与C o n t r o l 组相比，C s A 组S n a i l m R N A 的水平显著升高( P 0 0 5 ) ，治疗各组与C s A 组相比表