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1、第七章 免疫电镜,一 电镜免疫组织化学技术概述 二 几种常用的透射电镜方法要点,一 电镜免疫组织化学技术概述,特异性抗体用电子致密物质,如铁蛋白、胶体金等标记后,使之与组织超薄切片中的抗原结合,在电镜下观察到标记物所在位置,即为抗原抗体反应的部位。,(一)组织固定与取材 (二)免疫染色 (三)包埋 (四)对照试验,(一)组织固定与取材,原则: 既要保存良好的细胞超微结构,又要注意保持组织的抗原性。 固定: 固定剂的要求: 不损害细胞内抗原的活性; 固定速度快、效果好; 分子量小,易于渗透; 固定后,不引起交联,造成空间的阻碍,影响标记抗体进入抗原位。,影响固定的因素有: 固定剂的种类; 固定剂
2、的浓度,浓度过大,对抗原的活性有影响,浓度过小,固定效果差; 固定剂的pH; 固定剂的温度,一般采用24冷固定;这样能降低细胞自溶作用和水分抽提; 固定时间与温度有关,温度高,固定快,也与缓冲系的离子强度有关,离子强度大,渗透压大,穿透力强,固定要快。不同的固定剂,或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致; 与被固定的细胞类型有关。,选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。 多聚甲醛戊二醛混合液 过碘酸赖氨酸一多聚甲醛液(PLP液): 对含糖类丰富的组织固定效果特佳。 (使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价,作为失活参考以
3、再选择最适条件。),取材:免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。,灌流后需续固定:四氧化锇,(二)免疫染色,包埋前染色 包埋后染色 超薄切片免疫染色,1 包埋前染色,即先行免疫染色,在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出,修块;常规电镜方法处理,经锇酸固定、脱水、树脂包埋。 特异性免疫反应的范围太小,可作二次包埋: 即第一次包埋时将组织置于两层塑料片之间,中夹环氧树脂如夹心面包式,进行高温聚合,然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。,包埋前染色的组织,以中层较为理想。 表层因受机械修整,结构保存不好,深层因抗体不能透入,免疫反应弱或无。 半薄切片可在相差显微镜下不染色观察(PAP
4、),免疫反应部位呈黑点状; HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上,免疫反应部位呈棕黄色。 取相连续的超薄切片 为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆,分别以两个铜网捞取,其中之一进行染色观察,另一以铀单染色或不染色进行对照观察。,包埋前染色法的优点是: 切片染色前不经固定、脱水及包埋等过程,不破坏抗原。 在免疫反应阳性部位定位作超薄切片,提高电镜下的检出率。适用含抗原量较少的组织。,2 包埋后染色(载网染色),组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片; 免疫组化染色(载网染色) 注意事项: 四氧化锇具有保存抗原的作用,但应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。后固定中一般以不用四氧化锇为佳,或
5、尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。, 在载网染色过程中,铜网易与化学物质产生反应,故需选 用镍网或金网。 在免疫组化处理的全过程中,应注意保持网面的湿润,网 面干燥会影响抗体活性。,优点: 超微结构保存较好,方法简便,阳性结果有高度的可重复性, 还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。 缺点: 抗原活性在样品处理过程中可能减弱甚至丧失; 环氧树脂中可与组织成份发生反应而改变抗原性质; 包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。,解决对策: 去除包埋剂: 饱和苯溶液,无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等。 去除四氧化锇: 免疫染色前,将载网超薄切片以H202液蚀刻数分钟,以去锇和 增强树脂的穿
6、透性。,3 超薄冰冻切片,将组织置于蔗糖保护液中,以液氮速冻; 在冰冻超薄切片机上切片; 免疫染色。 不需经固定、脱水、包埋等步骤,所以抗原性保存 较好,兼有包埋前和包埋后染色的优点。但技术条 件要求较高、难度较大。,(三)包埋,树脂包埋、低温包埋,1 树脂包埋 环氧树脂包埋法 直接脱水后包埋 原位包埋:将小片组织或半薄切片贴在载片上, 将充满环氧树脂的明胶囊倒置 于切片上聚合、硬化,进行包埋。,2 低温包埋,低温包埋剂:,(1)Lowicryls: 是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质,包括K4M、HM20、K1lM、KM23等系列产品。 特点: 是能在低温下保持低粘度; 具有在光照射下聚合的能
7、力,光聚合作用与温度无关。,K4M和K11M具有亲水性,能较好地保持组织结构和抗原性,减少背景染色;HM20和HM23具疏水性,能产生高反差图像,适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。 K4M应用较多,1)包埋剂的配制: 由三个部分组成:单体,交联剂和引发剂。 调整单体、交联剂比例,增加交联剂,可增加组织块的硬度。 中等硬度的组织块,其配制比例如下: K4M:单 体 17.30g 交联剂 2.70g 引发剂 0.10g 可用微量注射器加针头抽取后,注入棕色玻璃容器避光,用 玻棒轻搅35 min或用一小管通入液氮气泡搅拌。勿过分搅拌, 以防氧的气泡进入包埋剂中。,K4M 的应用,2) 生物
8、样品处理程序 取材,以多聚甲醛一赖氨酸过碘酸钠固定; 含7蔗糖PBS,冲洗过夜; 0.1 molLPBS, pH 7.2冲洗; 系列脱水;, 包埋: 新鲜K4M置于胶囊内,将组织块移入,在-30-40以紫外线灯照射24h使之聚合。如为100W灯泡,照射距离应大于85 cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射23天,可增加其硬度,便于切片。,3) 免疫染色 切片贴在金网或覆有碳膜的镍网上; 正常羊血清30 min; 稀释一抗,372h; 可用烧杯法(或塑料壶喷洗法),以镊夹镍网在烧杯中洗荡; 正常羊血清30min。, 二抗以正常羊血清稀释,以镍网置于血清滴上孵育。 冲洗如。 覆于2OsO4水
9、溶液上,30min。 冲洗如。 干燥后在电镜下观察。 注意事项:所有步骤在室温、湿盒内进行;所有溶液需经微孔滤纸滤过。 Lowicryls 应保存在暗处,一4,该物质有刺激性,在配制时应戴手套,以免触及皮肤。在通风橱内操作,以免蒸汽刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛,应立即以水冲洗局部。,(2)LR white和LR gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂; 具有极低粘度和较强嗜水性,穿透性强,有利于抗体(或抗原) 和免疫化学物质穿过LR树脂,达到组织结合部位; 在免疫细胞化学的光镜(半薄切片)和电镜水平应用都具有良好 效果。 标本脱水至70乙醇即可,能较好地保持抗原性。 生物样品处理与免疫染色等
10、同常规树脂切片。,(3)GMA(乙二醇甲基丙烯酸酯) 优点: 电子密度大; 影像反差好。 缺点: 包埋聚合后的组织块很脆,不易修整和切片。 聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。 缺乏稳定性,不能承受电子束轰击,包埋剂遇热升华,造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。,环氧树脂: 有良好的塑料稳定性,能承受电子束的轰击不变形; 影像反差好,分辨率高; 半薄切片染色不够满意,效果不如GMA包埋切片的染色效果。,改进方法: 增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇 400改变其硬度。使之变软; 加入适量的交联剂乙烯二甲基丙烯酸酯以增强其抗电子束 轰击的稳定性。 选用低温型引发剂过
11、氧化苯甲酰避免聚合时过快,产生 高温,损伤组织结构。 GMA已广泛应用于半薄切片(13 um)的光镜观察,特别是 组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。,1) 过滤: GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂,用前须以每25ml单体溶液加一匙活性碳,在振荡器上振荡5 min,过滤以除去氢酯,以免影响聚合。 2) 包埋剂的配制: a. 100GMA N-甲基丙烯酸丁酯 66.5ml 5乙烯二甲丙烯酸酯 28.5ml 1.5过氧化苯甲酰 1.0g 1.0PEG 400 1.0ml,GMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免疫细胞化学染色方法:,bA液: GMA单体液 90ml PFG
12、 z300 59.4 ml 过氧化苯甲酰 0.20.69 g 搅拌溶解后置棕色瓶内;4保存。 B液: PEG z400 20 ml 二甲基苯胺 1 ml 应用时A:B按10:1比例充分混。,3) 生物样品处理: 组织固定可用PLP液或1戊二醛溶液(磷酸缓冲液配制,Ph7.4)。经系列酒精脱水至新鲜的GMA单体溶液中浸24h。 以上步骤可在室温或4进行。,4) 包埋聚合: 组织移入盛满包埋液的胶囊内,放在真空泵内以去除包埋液中的气泡,然后在4,以紫外线灯(波长360nm)在距胶囊底部1020cm处进行照射1216h,以手指捏胶囊试其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后,将胶囊丢人热水中以去除胶囊外
13、壳。,5) 包埋后染色:切片贴在镍网上,按胶体金标记蛋白A技术(PAg法)进行包埋后染色,铀、铅双染后,电镜观察。 低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的 包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的 多种抗原。,(四)对照试验: 略,免疫电镜技术存在的问题: 戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存,但对抗原活 性有影响; H202能增加树脂穿透性,但对微细结构有损伤,能使反应部 位产生孔洞。 染色中清洗工作不彻底,可产生非特异性产物和其他污染 物,影响特异性反应产物的显示和观察。,二、几种常用的透射电镜方法要点,(一)铁蛋白标记免疫电镜技术 (二)过氧化物酶标记免疫电镜技术 (三)胶
14、体金标记免疫电镜技术 (四)凝集素标记免疫电镜技术,(一)铁蛋白标记免疫电镜技术,1 原理 铁蛋白:是一种含铁约占23的蛋白质,铁蛋白含有致密的铁离子核 心,含20003000个铁原子,分布于四个区域,形成四个圆形致密 区,具有很高的电子密度,便于电镜观察。 抗体与铁蛋白通过双功能试剂结合为一种双分子复合物。,此复合物保留了抗体的免疫活性,通过电镜可定位抗原。适于细胞表面抗原的定位 优点:铁蛋白易从马脾中获得,呈颗粒状,易分辨; 缺点:分子量较大,不易穿透细胞膜和组织,对于细胞 内抗原的定位较困难。只适合电镜检查,不能用普通光学显微镜观察。因此,在近年来逐渐被免疫酶和胶体金取代。,2 电镜标本
15、的制备,(1)固定 同常规电镜(醛类和四氧化锇双固定) 铁蛋白标记抗体分子量大,如用于细胞表面抗原的定位研究, 可将样品直接放入固定液;细胞内抗原测定需: 冻融法:固定后冻融使细胞膜破裂,标记抗体能进入细胞内。 冰冻切片法:固定后速冻,切成10-15um薄片,融化的切片直接浸泡于铁蛋白标记的抗体液中。 戊二醛固定后,浸入洋地黄皂甙液中1-2min,增强细胞膜穿透性,使标记抗体进入细胞内,冰冻超薄切片铁蛋白标记抗体免疫电镜图,艾滋病患者血清的免疫电镜所见。 在病毒颗粒表面可见铁蛋白颗粒的吸附。,在细胞质的空泡内可见到大量的与细胞 外所见相同的病毒颗粒。,培养的成纤维细胞质膜对LDL的内吞作用 LDL颗粒与含铁的转铁蛋白共价相连, 电子显微镜下所见的黑点是小分子的铁。(a)LDL与细胞表面的受体结合并形成有网格蛋白包被的小窝;(b) 含有LDL的被膜小窝向下凹陷逐渐形成被膜小泡;(c) 含有转铁蛋白标记的LDL被膜小泡;(d)含有转铁蛋白标记的LDL颗粒的无被小泡(初级内体)。,(2) 免疫染色方法 常采用包埋前免疫染色,分为直接法和间接法。 (1)直接法: 切片直接浸于标记的特异性抗体内,室温或3712h以上; 缓冲液浸漂,除去未结合的标记抗体溶液; 再按常规电镜后固定、脱水、包埋。,(2)间接法: 将切片浸入一抗室温孵育3060min; 大量冷缓冲液充分