《生殖器疱疹和尖锐(1).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生殖器疱疹和尖锐(1).ppt（94页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生殖器疱疹和尖锐湿疣的实验室诊断,安徽省皮肤病防治所 樊春举,生殖器疱疹（GH）,（一）概念,生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒（HSV)感染泌尿生殖器及肛门部位皮肤黏膜而引起的一种常见的性传播疾病。 人类是HSV的唯一自然宿主。 生殖器疱疹可呈慢性复发过程，尚无彻底治愈的方法。,HSV是双链DNA病毒，圆形，直径180200nm。 中央为病毒核心，含有病毒基因组DNA， HSV-1和HSV-2同源性高达50%，其遗传特性较稳定。 表面包被20面体的核衣壳，核衣壳外有来自宿主细胞膜的含有多种病毒特异性糖蛋白的脂质包膜，即包膜糖蛋白。,HSV有两个抗原血清型：即HSV-1和HSV-2。 HSV-1主要感
2、染腰以上部位 HSV-2主要感染腰以下部位 生殖器疱疹主要由HSV-2感染引起（85%），少量是由HSV-1感染引起（因性行为方式的多样化，口腔与生殖器直接接触），有的可呈混合感染。 HSV-1复发率低，HSV-2复发率高。,包膜糖蛋白：,与病毒吸附和入侵宿主细胞、刺激机体产生免疫反应有关。 HSV有10 11种特异性糖蛋白抗原，是细胞和体液免疫的主要靶标。 gB gC gD gE gF gG gH gI gJ gL gM gpD：引发中和抗体的能力最强，因此是研制亚单位疫苗的最佳选择。 gG是型特异性糖蛋白，为HSV-1所特有，具有型特异性抗原决定簇，诱导产生特异性抗体。将HSV分为1型和2
3、型。,gB和gD：与特异性细胞受体相互作用的病毒配体分子，与病毒的吸附有关。 gE是Fc受体，能与IgG的Fc段结合。 gH和gL形成复合物，与病毒入侵细胞有关。,（二）临床表现,生殖器疱疹的潜伏期为220天，平均4 5天。 临床表现具有多样性: 原发性GH :潜伏期一般3 14日，临床表现为典型的集簇性水疱、脓疱、溃疡及结痂，也可表现为非特异性红斑、丘疹、裂隙和硬结等。病程大约2 3周。男性患者常见受累部位为包皮、冠状沟、龟头和阴茎干。女性多见于大小阴唇、会阴和子宫颈等处。常伴有全身不适感，低热、头痛等全身症状。局部淋巴结肿大。,复发性GH:一般在原发性GH皮损消退后的1 4个月内复发，复发
4、感染一般发生在原来部位。较原发性症状轻，病程短。 潜伏性GH： HSV感染者中约80-90%为潜伏感染。 潜伏性GH是本病的主要传染源，潜伏的HSV-2较潜伏的HSV-1更易被激发致病。,HSV具有嗜感觉神经节而形成潜伏感染状态的特性，HSV感染生殖器皮肤黏膜后常潜伏在骶神经根区。 潜伏感染是生殖器疱疹复发的根本原因。 触发潜伏HSV复发的因素： 免疫因素：免疫抑制或免疫缺陷 非免疫因素：激素内分泌因素与物理因素,子宫内感染：经胎盘或宫颈上行感染，导致胎儿早产、流产、畸形和死亡。 围产期：经产道40-60%机会被感染。 新生儿HSV感染以粘膜损害和内脏疾病为特征。多见于早产儿，特别致命的是脑炎
5、，若不及时治疗，死亡率高达50%以上，后遗症严重。,生殖器感染发病过程,（三）实验室诊断,病原学检测 细胞学染色 细胞培养 抗原检测（EIA/DFA） DNA检测 血清学检测,病原学检测,（1）细胞学染色 HSV感染细胞，可使细胞产生特征性改变。形成包涵体及多形核细胞，取其染色镜检。 方法：吉姆萨、巴氏、瑞氏染色。 结果：感染细胞中出现胞浆空泡 细胞融合成多核巨细胞，有 时可见核内包涵体。,方法学评价： 此方法简便、快速。 敏感性低，细胞学检测的敏感性只有抗原检测法、DNA检测法或病毒分离培养法的50-70%。感染HSV时具有特异性变化的细胞在疱疹或溃疡的基底数量最多，取材时应尽可能取基底部细
6、胞。,原发性生殖器疱疹时，细胞学检查容易成功，皮损早期取材效果较好。随皮损的愈合其病毒数量逐渐减少。 此方法不具有特异性，不能区分HSV-1和HSV-2感染，其它疱疹病毒（如水痘-带状疱疹病毒）感染也可引起相似的细胞病变。 不主张将细胞学检查应用于生殖器疱疹的临床诊断。,（2）细胞培养法 HSV培养的敏感细胞株有宫颈癌细胞（Vero）、非洲绿猴肾细胞（Hela）、乳地鼠肾细胞（BHK）等。 原理：HSV为细胞内寄生物，可在某些细胞系 中生长。因此，通过体外细胞培养法可分离检测到HSV。根据HSV感染细胞产生的特征性细胞病变（CPE），能初步确定HSV感染。,方法： 1.单层细胞的制备 将冻存的
7、细胞从液氮中取出，置37水浴中迅速融化，加入到含有细胞生长培养基的培养瓶中37孵育8小时，待细胞贴壁后换新鲜生长培养基继续培养23天，细胞融合为单层后，弃培养基，用适量的胰蛋白酶溶液于37消化单层4 5分钟，待细胞完全离散后加入生长培养基，配成所需的细胞浓度（大约105/ml）。分装于24孔培养板中，每孔加0.5ml细胞悬液。在37、5%CO2及湿润空气培养1-2天长成单层后即可用于接种。,2.标本接种 将标本振荡混匀后接种于易感细胞制成的单层细胞悬液 中，37温箱培养1小时，让病毒充分吸附到细胞上，再在37、5%二氧化碳环境中培养3-7天。每天观察病毒对细胞的致病变效应（CPF)。50%以上
8、细胞出现CPE后，取感染细胞用单克隆抗体的免疫荧光试验或酶免疫试验进行检测和分型。 CPE：初始时细胞浆颗粒增粗、细胞变圆，继而肿胀和气球样变，可见融合细胞和多核细胞。,结果： 出现典型CPE时报告“HSV初步培养阳性”。荧光检测时阳性细胞的胞浆和核内可见亮绿色荧光。免疫荧光鉴定和分型后报告“HSV培养阳性”同时报告相应的HSV类型。,方法学评价： 细胞培养法是HSV检测的金标准方法。 耗时较长：通常需2-4天，最长需14天。 标本需尽快接种或置-70 冻存。 敏感性受多种因素影响： 采集的标本中需有感染性病毒颗粒 避免杂菌污染 标本的来源部位不同，敏感性有差别,（3）HSV抗原检测,是目前最
9、常用的快速诊断方法。 HSV抗原检测法均以标记的特异性抗病毒抗体为基础，与待检标本中的抗原结合形成抗原抗体复合物，通过底物显色判断HSV抗原的存在。包括直接免疫荧光试验（DFA）、酶免试验（EIA）及酶联免疫吸附试验（ELISA）。,ELISA方法,将特异性HSV抗体(1、2型)包被在酶标板反应孔上，加入含有HSV抗原的标本及酶标记抗HSV抗体共同体孵育，反应形成抗原一抗体一酶标抗体复合物，在底物作用下产生颜色，颜色的深浅与抗原量成正比。 ELISA法方法简单、灵敏度和特异性高等优点。HSV抗原阳性表示HSV现症感染，对症状不典型患者更具诊断意义。不能区分HSV-1和HSV-2感染。可用于单纯
10、溃疡和生殖器疱疹的鉴别诊断。,直接免疫荧光试验（DFA),先将异硫氰酸萤光素(FTTC)与特异性抗HSV抗体结合，在一定条件下再与标本中相应HSV抗原产生反应，形成抗原一荧光抗体复合物，通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光，通过荧光判断HSV抗原的存在。 由于组织细胞中存在自然荧光，易出现非特异性结果，每次试验均应设置已知阳性和阴性标本对照。 选择特异性好，质量可靠的抗体，最好选用单抗。 能区分HSV-1和HSV-2感染。,方法学评价： 耗时耗力 对高危人群有价值，对于无症状患者的标本，敏感性50%。 一般用于HSV分离培养阳性标本的鉴定和分型。,HSV-DNA检测法,包括核酸分子杂交技术和聚合
11、酶链反应（PCR） 目前商品化的基因诊断试剂盒均选择高保守序列区，主要集中在DNA聚合酶基因区、胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因区和糖蛋白基因区。 核酸分子杂交技术： 应用DNA分子杂交技术检测HSV-DNA，其敏感性和特异性相当于免疫荧光试验。原理是使用商品化的生物素标记探针，通过原位杂交技术可检测临床标本中的病毒DNA，但操作较为复杂，实验要求较高。,聚合酶链反应（PCR）： 应用PCR体外扩增HSV-DNA片段，可增加HSV检出的敏感性。此法较病毒分离培养法及脑脊液病毒抗体检测更为敏感，且可同时对病毒进行分型。近年来出现的PCR-ELISA或PCR-微孔板杂交法，将PCR技术、核酸杂交技术和
12、酶联免疫技术结合起来，具有很多优点，在检测HSV的同时，还能检测梅毒螺旋体和杜克雷嗜血杆菌，用于以生殖器溃疡为特征的性病的诊断和鉴别诊断。,方法学评价： 除ELISA和直接涂片染色方法外，均可区分HSV-1和HSV-2感染。 DFA试验时应取溃疡基底部的细胞，尽可能多的获取感染性病毒颗粒。 PCR方法是成人及新生儿疱疹性脑膜炎的首选实验室诊断方法。,HSV感染的血清学检测,检测HSV抗体的方法有：检测HSV抗体的方法包括补体结合试验、中和试验、被动血凝试验、间接免疫荧光试验、免疫酶试验、放射免疫试验、ELISA、免疫印迹试验(WBA)。其中许多方法以感染1型和2型毒株的细胞培养物为抗原，难于区
13、分病毒抗体的类型。主要用于回顾性诊断原发性感染，对恢复期或复发性生殖器疱疹的诊断意义不大。,ELISA法检测HSV型特异性抗体 原理：用HSV型特异性抗原gG与待检标本中的特异性抗体结合形成复合物，底物显色。 方法：同一般的ELISA。不同的是加有标准管，用于计算抗体的相对含量。 结果：可用于IgG和IgM的相对定量检测。 方法评价： 用于HSV感染的诊断，首次感染93%IgM阳性。复发感染IgM阳性在13%以下，同时IgG滴度升高。作为原发和复发疱疹的鉴别。,用于HSV的分型诊断： HSV1和HSV2感染的严重程度和预后存在差异，为预后提供参考依据。 用于检出隐性感染者： HSV约有80-9
14、0%无症状感染， 可以减少性与母婴传播。 用于感染者性伴HSV感染状况的判断,用于HSV感染的血清流行病学调查： 为卫生监管部门提供更加有效、可靠的HSV的流行病学数据。 用于性病门诊（诊断与高危人群筛查） 产科门诊（孕前和产前筛查，减少新生儿疱疹感染。） 器官移植（检测HSV感染）,免疫蛋白印迹法： 原理：使用电泳在结合有HSV-1和HSV-2蛋白的硝酸纤维素膜上反应血清抗体的方法。 结果：用于检测复发、未被识别和潜伏感染。 方法学评价：优点是能高度准确的检测HSV亚型的感染。缺点是操作复杂。,GH实验室诊断方法的敏感性和特异性比较,方法 敏感性 特异性 细胞培养 25-90 99 金标准
15、直接涂片 40-50 95 非特异 DFA 70-95 90-100 抗原 gG 抗体检测 90 99 抗体 基因检测 95 98-100 基因,进行GH实验室检测的指征 男性： 阴茎、臀部、会阴有水疱或溃疡 淋菌性或非淋菌性尿道炎治疗后排尿困难 外阴皮肤反复发作的水疱或溃疡病史 女性： 生殖器、臀部、大腿有水疱或溃疡 粘液或脓性阴道分泌物,外阴及臀部皮肤反复发作的水疱或溃疡病史 新生儿： 母亲孕期有GH感染或发病史 皮肤水疱、结痂。 其它情况： 与确诊GH患者有性接触史 性工作者,尖锐湿疣（CA）,一、概念,是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的主要发生在肛门生殖器部位的表皮瘤样增生的一种性传
16、播疾病。 人是HPV唯一宿主。 HPV是乳头瘤病毒科的一种小的双链DNA病毒，具有嗜上皮性。病毒的种间不存在交叉感染，感染为局限性、非系统性的。99.7%的宫颈癌活检组织中有HPV存在，HPV是诱发宫颈癌的重要病原学因素。,乳头瘤病毒的基因组主要编码三组基因 三个癌基因，包括E5、E6和E7，负责调节癌细胞转化过程； 两个调节基因，包括E1和E2，负责调节转录和病毒基因组的复制； 两个结构蛋白基因，包括L1和L2，组成病毒颗粒,HPV 的主要致癌基因 E6 通过抑制 p53而阻断凋亡 E7 通过抑制pRB使细胞周期失控,L1: 主要衣壳蛋白，是疫苗的主要成分,L2: 次要衣壳蛋白，是市售抗体的主要识别位点,E4：结合并破坏细胞角蛋白网，形成挖空细胞的外观,E2：负性调节E6和E7，维持凋亡和细胞周期的调控。 通常在病毒发生
