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1、p53抑制剂对热化疗损伤结肠上皮细胞p53、 Bax和MDM2表达的影响 作者：张安平 刘宝华 张连阳 童卫东 何渝军 付涛【摘要】 目的 探讨p53抑制剂PFT(pifithrin alpha，PFT)对热化疗诱导原代培养结肠上皮细胞凋亡及p53靶基因Bax和MDM2表达的影响。方法 原代培养结肠上皮细胞分为正常对照组、热化疗组和PFT加热化疗组，运用顺铂联合温热(43 )处理结肠上皮细胞30 min，对比加入不同浓度的PFT后，Annexin VFITC/PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。MTT法分析PFT对热化疗杀伤DLD1细胞的影响。Western blot检测结肠上皮细胞的p53、B
2、ax和MDM2蛋白表达。结果 热化疗导致结肠上皮细胞发生凋亡，Bax和MDM2蛋白表达明显高于对照组。PFT作用于顺铂联合温热处理结肠上皮细胞后，细胞凋亡率下降呈剂量依赖性，同时p53在结肠上皮细胞胞核/胞质表达比例下降，Bax和MDM2的表达逐渐降低。热化疗杀伤肿瘤细胞的效应并未受到低剂量PFT影响。结论 PFT对热化疗损伤结肠上皮细胞具有保护作用，其机制可能与改变p53核转位和抑制促凋亡基因Bax和MDM2的表达相关，抑制p53可作为克服热化疗抗肿瘤治疗副效应的新策略。 【关键词】 基因表达 p53抑制剂 热化疗 结肠肿瘤 【Abstract】 Objective To investiga
3、te the effect of a p53 specific inhibitor, pifithrin alpha (PFT), on apoptosis of colonic epithelial cells and expressions of p53 target genes Bax and MDM2 in colonic epithelial cells injured by hyperthermic chemotherapy. Methods The primarily cultured colonic epithelial cells were divided into cont
4、rol group, hyperthermic chemotherapy group (HTC group) and PFT plus hyperthermic chemotherapy group (PFT plus HTC group). After the colonic epithelial cells were treated with hyperthermia at 43 and cisplatin at 10 mg/L for 30 minutes and added with PFT at different concentrations, apoptosis rate was
5、 detected by using flow cytometry with Annexin VFITC and PI double labeling method. The influence of PFT on antitumor potency of hyperthermic chemotherapy was analyzed with using methabenzthiazuron (MTT) assay. The expressions of p53, Bax and MDM2 were measured by Western blot. Results FCM analysis
6、showed that hyperthermic chemotherapy induced apoptosis of colonic epithelial cells, with higher protein expressions of Bax and MDM2 compared with control group. The apoptosis rate was reduced in a dosedependent manner after colonic epithelial cells were exposed to PFT. Western blot analysis reveale
7、d that PFT decreased the nucleartocytoplasmic p53 ratio, with gradual decrease of expressions of Bax and MDM2. At lower dosages, PFT did not interfere with the antitumor potency of hyperthermic chemotherapy. Conclusions PFT protects colonic epithelial cells injured by hyperthermic chemotherapy, whic
8、h suggests that PFT may change p53 nuclear translocation and downregulate expressions of proapoptotic Bax and MDM2. Inhibition of p53 can be a new measure for overcoming side effect of hyperthermic chemotherapy for antineoplaston. 【Key words】 Gene expression; p53 specific inhibitor; Hyperthermic che
9、motherapy; Colon tumor 胃肠道肿瘤术后常因腹腔内残留游离癌细胞或残余微小癌灶导致复发，温热化疗可有效杀灭游离癌细胞或残余微小癌灶，预防复发和提高术后生存率。但是温热化疗在杀伤肿瘤细胞的同时对增生活跃的肠上皮细胞产生损伤，导致如恶心、呕吐和腹泻等抗肿瘤副效应。这种副效应常因p53激活诱导肠上皮细胞凋亡引起1-2。p53特异性抑制剂PFT可以阻断阿霉素、紫杉醇、射线等诱导的p53激活，降低正常组织的凋亡3-4。我们探讨通过PFT暂时抑制p53，观察其对顺铂联合温热损伤肠上皮细胞的p53及其靶基因Bax和MDM2蛋白表达的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 参照文献5进行结肠
10、上皮细胞体外培养。PFT为Calbiochem公司产品，顺铂、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)和碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)为Sigma公司产品，Western Blot发光试剂盒、p53单抗、Bax和MDM2单抗均购自Santa Cruz公司，Annexin VFITC购自BD公司， DMEM培养液、 RPMI1640培养液、 胎牛血清购自Hyclone公司， 其他试剂和药品为国产或进口分装。 张安平，等. p53抑制剂对热化疗损伤结肠上皮细胞p53、Bax和MDM2表达的影响及意义 1.2 MTT分析 对数生长期的大肠癌细胞系DLD1细胞以4
11、103个/孔接种于96孔培养板培养用RPMI1640培养液24 h后，吸除培养液后加入含0.4%血清的RPMI1640同步化细胞48 h，分别加入含PFT 5、10、20、30、40、50、60 mol/L的RPMI1640培养液180 ml孵育4 h后进行热化疗处理，在热化疗处理完毕后用PBS洗细胞两次，再重新加入上述PFT后将细胞放入孵箱培养。另一组只加入上述不同剂量PFT而不进行热化疗处理。每组6个复孔培养24 h后，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 ml继续培养4 h终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO 150 ml振荡10 min使结晶充分溶解，用酶标仪在570 nm
12、波长处测定各孔的吸光度值。 1.3 分组及处理 将对数生长期结肠上皮细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，每孔5104个细胞接种于6孔培养板培养24 h后，将培养细胞分为3组：(1)正常对照组(control group，CON)；(2)热化疗组(hyperthermic chemotherapy group，HTC)：顺铂溶于DMSO中，终浓度为10 mg/L加入培养板中，在43 恒温水浴箱中处理30 min后，用PBS洗细胞两次，加入培养基将细胞放入孵箱培养2 h；(3)PFT+热化疗组(PFTHTC)： PFT在临用前溶解于DMSO，在热化学处理前4 h以10、20、30、40 mol/L加
13、入培养板中，然后处理同热化疗组，在热化疗处理完毕后用PBS洗细胞两次，再重新加入上述PFT后将细胞放入孵箱培养2 h。 1.4 细胞凋亡检测 收集各组细胞，2 000 r/min，4 离心5 min后，冷PBS重悬，离心，弃上清再次重悬离心，加Annexin VFITC溶液5 l和PI溶液2.5 l到100 l细胞悬浮液中，混匀后避光反应10 min，加150 l样品稀释液到样品中，混匀后上机检测。 1.5 Wesrtern blot检测 提取结肠上皮细胞胞质、胞核总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度后上样，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后行半干转膜至PVDF膜上，封闭液封闭后依次加入p5
14、3单抗、Bax和MDM2单抗(一抗1200)和辣根过氧化物酶标记的IgG(二抗12 500)室温孵育，再加入化学发光试剂与PVDF膜共孵育后进行自显影。用扫描分析软件 (Labwork 4.0)测量Western blot积分光密度值(IOD)，以正常对照组实际IOD值为参照，其他组别的IOD与之相比的相对积分光密度为蛋白的表达量。 1.6 统计学处理 各组数据均以s表示。以SPSS 11.5版统计分析软件对各组数据进行t检验和单因素方差分析。 2 结果 2.1 PFT对热化疗抗肿瘤细胞能力的影响 DLD1细胞在无热化疗作用下，PFT达50 mol/L时，PFT对DLD1细胞生长具有一定的抑制
15、效应，当达60 mol/L，抑制效应更趋明显(P<0.01)。PFT自身表现出对DLD1细胞的毒副效应。PFT联合热化疗处理DLD1细胞时，当PFT低于40 mol/L，对热化疗杀伤DLD1细胞无增强或减弱效应，当达50和60 mol/L，PFT显著增强热化疗对DLD1细胞的杀伤效应，表现出细胞毒副作用的叠加效应(图1)。 2.2 PFT对热化疗诱导结肠上皮细胞凋亡的影响 肠上皮细胞自然凋亡率在(2.880.44)%，热化疗损伤后其凋亡率达(27.032.07)%，PFT呈剂量依赖性抑制热化疗诱导的肠上皮细胞凋亡，凋亡率由(14.831.51)%逐渐下降至(3.750.33)%，与热化疗组相比凋亡率显著下降(P<0.01)(表1)。表1 各组结肠上皮细胞凋亡率变化 2.3 PFT对结肠上皮细胞胞核和胞质p53表达的影响 Western blot分析显示热化疗损伤后p53主要在细胞核表达，胞核/胞质比值为13.22。10 mol/L PFT作用后胞质表达升高，胞核表达减少，胞核/胞质比值下降至0.80，40 mol/L PFT作用后这种变化更显著。与热化疗组相比p53胞核/胞质表达比差异有统计学意义(P<0.01)(表2)。表2 p53在结肠上皮细胞胞核和胞质表达变化 2.4 PFT对结
