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1、二苯乙烯苷对D-半乳糖致拟痴呆小鼠学习记忆和海马APP、A表达的影响 作者：黄忠仕，谢海源，农嵩，李韬，张树球 【摘要】 目的 观察二苯乙烯苷（TSG）对D-半乳糖致拟痴呆小鼠学习记忆能力及海马淀粉样蛋白前体(APP)、淀粉样蛋白(A)表达的影响。方法 连续给昆明种小鼠灌胃TSG 50天，同时每天颈部皮下注射D-半乳糖建立痴呆小鼠模型，以Morris水迷宫为学习记忆评价指标，并采用免疫组化及图像分析测定各组小鼠海马组织APP、A平均光密度和阳性细胞数。结果 在隐蔽平台试验中拟痴呆小鼠表现出明显的学习记忆障碍，逃避潜伏期显著延长（P<0.05），TSG各剂量组逃避潜伏期较模型组显著缩短（P
2、<0.05）；探索试验中TSG各剂量组原平台象限的停留时间和穿越原平台次数明显多于模型组。与模型组比较，TSG各剂量组能降低拟痴呆小鼠脑内APP、A平均光密度值和阳性细胞数(P<0.05)。以上效应均呈现一定的量效关系。结论 TSG各剂量能明显地改善拟痴呆小鼠的学习记忆能力，能减少或抑制APP、A的过度产生，保护神经元免受A的神经毒性。 【关键词】 二苯乙烯苷 痴呆 学习记忆能力 淀粉样蛋白前体 淀粉样蛋白 小鼠 动物 实验Abstract: Objective To study the effects of 2, 3, 5, 4-tetrahydroxy-stilbene-2-O
3、-D-glylcoside (TSG) on learning and memory abilities and expressions of -amyloid precursor protein (APP) and -amyloid (A) in hippocampus of mice with dementia induced by D-galactose. Methods After the mice were treated with intragastric administration with TSG for 50 days continually, the mice were
4、treated subcutaneous injection with D-galactose at the same time to establish the dementia model, then the Morris water maze test was performed to survey the learning and memory abilities, and the immunohistochemical analysis and computerized image presentation analysis system were used to determine
5、 the APP and A average optical density and their immunoreactive neurons in hippocampus. Results The mice with dementia had learning and memory disorders during hidden platform test, and the escape latency were significantly longer than that of TSG-treated groups (P<0.05). TSG-treated groups could
6、 significantly prolong the staying time and the frequency of crossing original platform quadrant in spatial probe test (P<0.05). Compared with model group, TSG-treated groups could decrease significantly the APP and A average optical density and their immunoreactive neurons in hippocampus of mice
7、 with dementia via immunohistochemical analysis (P<0.05). All the data showed a dose-response relationship to some degree. Conclusion TSG can improve the learning and memory abilities in mice with dementia and reduce or inhibit the over-expression of APP and A in hippocampus of mice with dementia
8、, so as to protect the neurons from the neurotoxicity of A. Key words: 2,3,5,4- tetrahydroxy-stilbene-2-O-D-glylcoside; dementia; learning and memory abilities; -amyloid precursor protein; -amyloid; mice; animals, experiments阿尔茨海默症（Alzheimers disease, AD）是一多发在老年，以近期记忆障碍为主要临床症状，老年斑（SP）、神经元纤维缠结（NFT）和神
9、经元丢失为主要病理改变的进行性神经变性疾病。目前AD的发病机制尚未完全清楚，亦无良好的防治措施，因此研究AD的发病机制和开发新的治疗药物成为当前研究热点之一。二苯乙烯苷（2,3,5,4-四羟基-二苯乙烯-D-葡萄糖苷，TSG）是何首乌中的主要水溶性成分，近年来发现其具有抗衰老作用、神经保护作用、降血脂及抗动脉粥样硬化作用等1,2。其作用机制是多靶点、多环节、多途径的，因此对老年性痴呆等神经退行性病变的防治具有很好的应用价值，可开发研制为治疗老年性痴呆的新药物。本实验以D-半乳糖建立拟痴呆小鼠模型，观察TSG对拟痴呆小鼠学习记忆及海马组织淀粉样前体蛋白（-amyloid precursor pr
10、otein, APP）、淀粉样蛋白（-amyloid, A）表达的影响，现报道如下：1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重202g，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXKG桂2003-0003，实验动物使用许可证：SYKG桂2003-0005）。1.1.2 主要试剂D-半乳糖（Sigma公司提供）；石杉碱甲（豫中制药厂生产，批号：H10940156）；一抗：-Amyloid precursor protein，-Amyloid兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德公司生产，批号：BA0580）；二抗：即用型快捷MaxvisionTM检测试剂盒；DAB显色
11、试剂盒（福建迈新公司生产）。1.1.3 主要仪器设备Morris水迷宫（中国科学院药研所制）；湖北孝感亚鹏TS-12U生物组织自动脱水机；武汉俊杰JB-L5生物组织石蜡包埋机；Shandon切片机；奥林巴斯光学显微镜；重庆天海彩色病理图像分析系统；恒温培养箱。1.2 方法1.2.1 动物分组与给药方式将昆明种小鼠60只随机分为6组（每组10只）：正常对照组；模型组；石杉碱甲组；TSG低剂量组；TSG中剂量组；TSG高剂量组。各组均按0.2ml/10g体重给药，组每天灌0.9%生理盐水；组灌石杉碱甲0.02mg/kg体重；组灌TSG 0.033g/kg体重；组灌TSG 0.1g/kg体重；组灌T
12、SG 0.3g/kg体重。组同时颈部皮下按120mg/kg体重注射D-半乳糖（配成0.6%浓度），每天一次，连续50天。1.2.2 隐蔽平台试验从第46天起，进行Morris水迷宫试验，连续5天。Morris水迷宫为一不锈钢的圆形水池，内壁黑色，直径100cm，高50cm，水温控制在（221）。水池等分为4个象限，任选其中1个象限，正中放置1个安全平台。平台为圆形，直径10cm，没于水下1cm。水池放在一间小屋的中央，室内的门、窗、摄像头等构成视觉暗示。迷宫上方安有摄像机，并和计算机连接，自动录入小鼠游泳轨迹并进行分析。历时5天，每天上下午各1次，入池位置为平台所邻2个象限的池壁中点。将小鼠面
13、向池壁分别从入水点放入水中，记录其在100s内寻找到平台的时间（逃避潜伏期，escape latency）。如果小鼠在100s未找到平台，则由实验者用手牵引其至平台上，停留10s，逃避潜伏期记成100s。每天以两次潜伏期算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。1.2.3 探索试验撤除平台，任选1个入水点将小鼠放入水中，使小鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台，记录其100s的游泳轨迹、原平台象限游泳的时间和穿越原平台的次数。1.2.4 免疫组化测定APP和A治疗结束后，处死小鼠，冰上迅速取出小鼠脑组织，放置-80冰箱保存。切片前从-80取出，依次放入-20、4冰箱各半小时，再用10%福尔马林固定。依
14、次脱水，浸蜡，包埋，连续切片。采用MaxvisionTM快捷免疫组化染色法测定，切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；APP，A在pH 6.00.1柠檬酸缓冲液于压力锅中加热至沸腾修复抗原1.5min；每张切片加50l 3%过氧化氢，室温下孵育10min以阻断内源性过氧化物酶的活性；再加50l的APP或A兔抗大鼠多克隆抗体（均按1100稀释），在4温度下孵育过夜；随后加50l即用型快捷MaxvisionTM检测试剂盒的二抗，室温下孵育15min；DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤终止反应，苏木素轻度复染30s，自来水冲洗，返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。经DAB显色，
15、A、APP阳性细胞为棕黄色。用PBS代替一抗作为阴性对照。在APP、A免疫组化染色切片的海马区各取3个视野（400），应用图像分析系统测量每个视野内APP、A平均光密度和阳性细胞数。1.2.5 统计方法所有检测结果以s表示。用SPSS10.0统计软件分析，两组间均数比较采用t检验。2 结果2.1 隐蔽平台试验结果见表1。由表1可以看出，隐蔽平台试验从第1天起，模型组的逃避潜伏期即明显短于正常对照组（P<0.05或P<0.01），说明长期注射D-半乳糖后，小鼠的学习记忆明显下降。石杉碱甲组和TSG组从第3天起，逃避潜伏期明显短于模型组（P<0.05或P<0.01），说明用药后能改善拟痴呆小鼠的学习记忆能力。TSG组与阳性药石杉碱甲组比较差异无显著性(P>0.05)。表1 TSG对D-半乳糖致拟痴呆小鼠隐蔽平台试验逃避潜伏期的影响（略）2.2 探索试验结果见表2。正常对照组、石杉碱甲组和TSG各组轨迹大部分位于原平台象限，其次较多地在原平台象限相邻的左右两侧象限寻找，但模型组基本围绕池壁游泳，其运动轨迹呈随机分布于各象限之中。由表2可以看出，正常对照组、石杉碱甲组和TSG各组的停留原平台象限时间和穿越原平台次数均明显多于模型组，差异具有显著性（P<0.05或
