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1、生化复习资料第一章一、 蛋白质的生理功能蛋白质是生物体的基本组成成分之一，约占人体固体成分的45%左右。蛋白质在生物体内分布广泛，几乎存在于所有的组织器官中。蛋白质是一切生命活动的物质基础，是各种生命功能的直接执行者，在物质运输与代谢、机体防御、肌肉收缩、信号传递、个体发育、组织生长与修复等方面发挥着不可替代的作用。二、 蛋白质的分子组成特点蛋白质的基本组成单位是氨基酸 编码氨基酸:自然界存在的氨基酸有300余种，构成人体蛋白质的氨基酸只有20种，且具有自己的遗传密码。 各种蛋白质的含氮量很接均为16。 每100mg样品中蛋白质含量（mg%）：每克样品含氮质量（mg）6.25100。氨基酸的分
2、类 所有的氨基酸均为L型氨基酸（甘氨酸）除外。 根据侧链基团的结构和理化性质，20种氨基酸分为四类。1 非极性疏水性氨基酸：甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）。2 极性中性氨基酸：色氨酸（Trp）、丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）、天冬酰胺（Asn）、谷胺酰胺（gln）、苏氨酸（Thr）。3 酸性氨基酸：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）。4 碱性氨基酸：赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His）。 含有硫原子的氨基酸：蛋氨酸（又称为甲硫氨酸）、半胱
3、氨酸（含有由硫原子构成的巯基SH）、胱氨酸（由两个半胱氨酸通过二硫键连接而成）。 芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。 唯一的亚氨基酸：脯氨酸，其存在影响-螺旋的形成。 营养必需氨基酸：八种，即异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸。可用一句话概括为“一家写两三本书来”，与之谐音。氨基酸的理化性质 氨基酸的两性解离性质：所有的氨基酸都含有能与质子结合成NH4的氨基；含有能与羟基结合成为COO的羧基，因此，在水溶液中，它具有两性解离的特性。在某一pH环境溶液中，氨基酸解离生成的阳郭子及阴离子的趋势相同，成为兼性离子。此时环境的pH值称为该氨基酸的等电点（pI），
4、氨基酸带有的净电荷为零，在电场中不泳动。pI值的计算如下：pI1/2（pK1 + pK2）,(pK1和pK2分别为-羧基和-氨基的解离常数的负对数值)。 氨基酸的紫外吸收性质 吸收波长：280nm 结构特点：分子中含有共轭双键 光谱吸收能力：色氨酸酪氨酸苯丙氨酸 呈色反应：氨基酸与茚三酮水合物共加热，生成的蓝紫色化合物在570nm波长处有最大吸收峰；蓝紫色化合物（氨基酸加热分解的氨）（茚三酮的还原产物）（一分子茚三酮）。肽的相关概念寡肽：小于10分子氨基酸组成的肽链。多肽：大于10分子氨基酸组成的肽链。氨基酸残基：肽链中因脱水缩合而基团不全的氨基酸分子。肽键：连接两个氨基酸分子的酰胺键。肽单元
5、：参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，组成肽单元。三、 蛋白质分子结构特点见表1-1。表1-1蛋白质分子结构的比较一级结构二级结构三级结构四级结构定义指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序蛋白质主链的局部空间结构、不涉及氨基酸残基侧链构象整条肽链中所有原子在三维空间的排布位置各亚基间的空间排布表现形式-螺旋、-折叠（片层）、-转角、无规卷曲结构域、模体（锌指结构）亚基聚合维系键肽键(主要)二硫键(次要)氢键次级键（疏水作用、盐键、氢键、范德华力）亚基间的次级键特殊脯氨酸的存在或者多个谷、天冬氨酸的存在都会干扰-螺旋的形成 模体：蛋白质分子中，由两个以上具有二级结构的肽段在空间上相
6、互接近，形成一个特殊的空间构象并发挥特定的作用。 锌指结构：是一个典型的模体，由一个-螺旋和二个反平衡的-折叠的3个肽段组成，具有结合锌离子的功能。 分子伴侣：能够可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，引导肽链正确折叠的存在于细胞内的一类蛋白质，也对蛋白质二硫键正确形成起到重要作用。四、 蛋白质一级结构与空间结构的关系 一级结构是空间构象的基础，具有相似一级结构的多肽或蛋白质，其空间构象及功能也相似。 分子病：由于蛋白质分子一级结构发生改变，导致其功能改变而产生的疾病。五、 蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质空间结构由一级结构决定，其空间结构与功能密切相关。 血红蛋白（Hb）由四个亚基组成
7、，两个亚基，两个亚基。记忆要点如下： 血红蛋白分子存着紧张态（T）和松弛态（R）两种不同的空间构象。 T型和氧分子亲和力低，R型与氧分子的亲和力强，四个亚基与氧分子结合的能力不一样。 第一个亚基与氧分子结合后，使Hb分子空间构象发生变化，引起后一个亚基与氧分子结合能力加强(正协同效应)。 肌红蛋白分子只有一个亚基，不存在变构效应 协同效应：指一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中的另一个亚基与配体的结合能力。促进作用则为正协同效应；反之为负协同效应。 变构效应：蛋白质分子的亚基与配体结合后，引起蛋白质的构象发生变化的现象。 结构域：大分子蛋白质可折叠成多个结构较为紧密的区域，各行使其功能，称
8、为结构域。 疯牛病：是由朊病毒蛋白引起的一组人和动物神经退行性病变，具有传染性、遗传性或散在发病的特点。生物体内含有正常的-螺旋形式的PrPc，转变为异常的-折叠形式的PrPSc具有致病性。六、 蛋白质重要的理化性质及相关概念 蛋白质的等电点：当蛋白质在某一pH溶液中时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，带有的净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。体内的蛋白质等电点各不相同，大多数接近于pH5.0碱性蛋白质：鱼精蛋白、组蛋白酸性蛋白质：胃蛋白酶、丝蛋白蛋白质处于大于其等电点的pH值溶液中时，蛋白质颗粒带负电荷。反之则带有正电荷。 蛋白质胶体溶液稳定的两个因素：水化膜、表
9、面电荷。 蛋白质的变性：在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，导致理化性质的改变和生物活性的丧失。变性的本质：二硫键与非共价键的破坏，不涉及肽键的断裂变性后特点：生物学活性丧失、溶解度下降、粘度增加、结晶能力消失、易被蛋白酶水解变性的因素：加热、乙醇、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等蛋白质复性：变性程度较轻，去除变性因素后，仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能蛋白质的凝固作用：蛋白质经强酸或强碱变性后，仍能溶解于该溶液中。若调节pH值至其等电点时，变性蛋白质呈絮状析出，再加热，形成坚固的凝块。蛋白质的复性：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的
10、构象和功能，称为复性。 蛋白质的紫外吸收：含有具有共轭双键的三种芳香族氨基酸，于280nm波长处有特征吸收峰。 蛋白质的呈色反应：茚三酮反应：蛋白质水解后可产生游离的氨基酸，原理同前双缩脲反应：肽键与碱性硫酸铜共热，呈现紫色或红色。氨基酸不出现此反应，当蛋白质不断水解时，氨基酸浓度上升，其双缩脲呈色浓度逐渐下降，因此可以检测蛋白质的水解程度。七、 蛋白质的分离纯化 透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜的方法。 丙酮沉淀：0-4低温；丙酮的体积10倍于被沉淀蛋白质；蛋白质沉淀后应迅速分离。 盐析：硫酸铵、硫酸钠
11、或氯化钠等中性盐放入蛋白质溶液中，破坏水化膜并中和表面电荷，导致蛋白质胶体的稳定因素去除而沉淀。 免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，形成抗原抗体复合物，从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白的方法。 电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中，受到电场力的作用向正极或负极泳动。 SDS-PAGE电泳：加入负电荷较多的SDS（十二烷基磺酸钠），导致蛋白质分子间的电荷差异消失，此时蛋白质在电场中的泳动速率只和蛋白质颗粒大小有关，用于蛋白质分子量的测定。 等电聚焦电泳：在电场中形成一个连续而稳定的线性pH梯度，电泳时被分离的蛋白质泳动至其等电点相等的pH值区域时，净电荷为零不再受电场力移动，该法
12、用于根据蛋白质等电点的差异进行分离。 层析：待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。 阴离子交换层析：负电量小的蛋白质首先被洗脱 凝胶过滤：分子量大的蛋白质最先洗脱 超速离心：既可分离纯化蛋白质也可测定蛋白质的分子量； 对于球形蛋白质而言，沉降系数S大体上和分子量成正比关系 S（未知）/S（标准）Mr（未知）/Mr（标准）2/3八、 多肽链氨基酸序列分析方法及关键试剂名称氨基酸序列分析 步骤一：分析已纯化蛋白质的氨基酸组成 步骤二：测定多肽链的氨
13、基末端与羧基末端为何种氨基酸。以前用二硝基氟苯，现多用丹酰氯 步骤三：将肽链水解成片段（表1-2）。表1-2三种肽链水解方式的比较胰蛋白酶胰凝乳蛋白质酶溴化氢法作用部位赖氨酸或精氨酸羧基侧的肽键芳香族氨基羧基侧的肽键甲硫氨酸羧基侧的肽键 步骤四：测定各肽段的氨基酸排列顺序，采用Edman降解法，试剂为异硫氰酸苯酯 步骤五：统计学分析，组合排列对比，得到完整肽链氨基酸排列顺序通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列的步骤： 步骤一：分离编码蛋白质的基因 步骤二：测定DNA序列 步骤三：排列出mRNA序列 步骤四：按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列蛋白质空间结构测定蛋白质二级结构含量测定：圆二色光谱法
14、，测-螺旋较多的蛋白质时，结果较为准确。蛋白质三维空间结构测定：X射线衍射法和磁共振技术。第二章一、 核酸的分类、细胞分布、核酸元素组成特点及碱基、核苷、核苷酸的化学结构 核酸是生物遗传的物质基础，是一切生物体所含有的最重要的生物大分子之一。天然存在的核酸根据其分子的物质组成不同分为两大类：DNA与RNA。 核酸的元素组成：主要由碳、氢、氧、氮（N）、磷（P）组成，磷的含量较为稳定，占核酸总量的9-10%。 基本组成：核酸的基本组成是核苷酸。磷酸磷酸核苷酸核糖碱基核酸分子核苷二、 核苷酸间的连接方式3,5-磷酸二酯键；5末端是指在DNA或RNA链中末端为5-磷酸基，未形成磷酸二酯键的一端；3末端是指在DNA或RNA链中末端为3-OH，未被酯化的一端；各种简化式书写时都是53，其读向都是从左到右，所表示的碱基序列也都是从5端到3端。三、 两类核酸（DNA与RNA）性质的异同详见表2-1。表2-1DNA与RNA性质的比较DNA RNA 名称脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸碱基组成A、T、C、GA、U、C、G戊糖组成-D-2-脱氧核糖-D-核糖类型DNAmRNA、tRNA、rRNA等核苷酸/脱氧核苷酸dATP、dTTP、dCTP、dGTPATP、UTP、CTP、GTP分布部位98%在细胞核中2%在线粒体中90%分布于胞液10%分布于细胞核基本结构反向平行互补双螺旋
