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1、生物化学实验,温州医学院生物化学教研室 毛孙忠 7A211 86689978,氨 基 酸 薄 层 层 析,Thin Layer Chromatography Of Amino Acid,层 析,层析原理 待分离物质（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离物质各组分颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离物质中各组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离混合物的目的 。,层析概念 层析为实验室一类分离技术的总称。,层 析 分 类,按流动相,气相层析,液相层析,按固定相形状,柱层析,薄层层析,纸层析,层 析 分 类,类别 分离原理 基质或载体 吸附层析 化学、物理吸附 硅
2、胶、氧化铝 、羟基磷酸 分配层析 两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土 、硅胶 凝胶过滤 分子筛效应的排阻效应 琼脂糖、葡聚糖 离子交换层析 离子基团的交换反应 离子交换树脂 、纤维素、 葡聚糖 亲和层析 分离物与配体之间有 带配基的琼脂糖 特殊亲和力 或葡聚糖,原 理,薄层层析由一平铺固定于玻璃板或塑料板的固定相及一由有机溶剂构成的流动相组成。样品点在固定相，由于样品中不同的成分被固定相吸附剂吸附的牢固程度不同及在有机溶剂中溶解性质不同，当有机溶剂因为毛细管作用沿吸附剂上升时，不同的成分而被分开。当与一标准物同时层析时，可鉴定未知样品中的不同成分。,操 作,制板 点样 展层 染色 Rf (R
3、etention factor) 计算,1.点 样,2cm,铅笔划线,(小、均匀),2.展 层:,30,30 板要端正 划线端朝上/下?,先吹干,3.染 色:,标记溶剂前沿 吹干 喷茚三酮 吹干,4.测量并计算Rf,=,AA斑点中心到底线距离,溶剂前沿到底线距离,前 沿,三种氨基酸Rf的计算,实验室规则,、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静，不得喧哗吵闹、迟到、早退、缺席。每次实验都要穿白大褂、禁止穿拖鞋。 、爱护仪器，厉行节约。取用试剂时，应仔细辨明标签，以免取错。取完试剂后，应及时盖好瓶盖，放回原处，切忌乱拿乱放、“张冠李戴”。,3、注意安全、对于有毒、腐蚀的试剂更应注意，应避免其直接接触人
4、体及衣物。 4、注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒入水槽，放水冲走。实验用过的和棉花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随意乱扔或丢进水槽。实验结束后应将实验台整理好。并清扫、整理实验室。关好水、电、门、窗。,一、层析技术,1、层析技术概念 2、层析技术分类 3、常用层析技术原理,色谱起源,色谱,组分,色素,石油醚,碳酸钙颗粒,用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography)，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的,层析：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相
5、中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。,1、层析技术概念,2、层析技术分类,（1）吸附层析,原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。 由此产生：吸附 脱离 再吸附 再脱离 的现象 吸附剂：硅胶、氧化铝、活性炭；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。,3、常用的层析原理,（2）分配层析纸层析 原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（）。 固定相内溶质的浓度 = 流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水 流动
6、相：有机溶剂（正丁醇）,（3）离子交换层析,原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。 常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯） 阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：Na+、H+ 阴离子：Cl-、OH-,带正电荷多蛋白紧密结合,带负电荷多蛋白流过层析柱,阳离子交换树脂工作示意图,阳离子交换树脂,（4）凝胶过滤,原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。 物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。 凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。,（5）亲和层析,原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。 专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体 载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。,生化实验仪器清单,
