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1、Chapter 15 DNA的复制、修复和重组,1. 掌握遗传信息传递的中心法则。 2. 掌握DNA复制的一般规律：DNA的半保留复制、DNA的半不连续复制的概念。 3.了解三种大肠杆菌DNA聚合酶的催化特性及其功 用；了解原核生物DNA的复制过程。 4.了解使DNA损伤的因素；DNA损伤的修复机制： 错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、直接修 复、重组修复及倾向差错的修复的过程及过程所需要 的酶类；了解DNA损伤修复的意义。,目的要求,1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。 1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录及RNA的复制存在于R
2、NA病毒,中心法则,复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一 系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白 质的氨基酸顺序的过程。 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶作用下，生成DNA的过程。,几个基本概念,中心法则图示,1 DNA的代谢 一、DNA代谢包括DNA复制、修复和重组 二、大肠杆菌遗传图 遗传图：通过遗传学方法测定的一物种各基因沿着染色体相对顺序和位置的排列图。,一
3、、关于模板的概念 二、DNA的半保留复制 1. 定义 以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA， 而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。 2. 半保留复制的实验证据 1958年Meselson和Stahl用15N 标记大肠杆菌DNA，首先证明了DNA的半保留复制。,2 DNA复制的一般规律,全保留与全新复制,分散复制,半保留复制,DNA半保留复制图示,半保留复制的证明,Meselson和Stahl将15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌DNA都带上15N标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培
4、养基中培养后,分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯 化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。,亲代DNA（15N15N）,子一代DNA（15N14N）,子二代DNA(15N14N,14N14N 1:1),子三代DNA(15N14N,14N14N 1:3),子四代DNA(15N14N,14N14N 1:7),亲代DNA与子二代DNA的混合物,亲代DNA与子四代DNA的混合物,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图,DNA半保留复制的生物学意义,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。 DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性
5、物。,三、DNA复制的起点与方向,双向复制,单向复制,复制中的DNA,DNA复制的主要方式,大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制） 真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双 向复制） 单向滚环式复制（噬菌体X174DNA 单链环状）,不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链 的复制起点不同位置，且复制不同步）,四、DNA复制的半不连续性,前导链,滞后链,冈崎片段,前导链：以3 5 方向的亲代链为模板连续合成的子代链。,滞后链：以5 3方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片 段，再连接成滞后链。,半不连续复制的发现,日本学者冈崎（1968
6、 ）：用3H dT标记T4噬菌体感染大肠杆菌 短时间内分离的DNA均为DNA小片段 一段时间后 检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶缺失的变异株时，检测到 大量DNA小片段的积累。证明DNA复制中有小片段合成。,一、DNA是由DNA聚合酶催化合成的,原料：四种脱氧核苷三磷酸（dNTP） 需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链, 也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。 需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA 的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3-OH。 合成方向：5 3,3 DNA聚合酶,1956年，Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA
7、聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下：,二、DNA复制的精确性（高保真复制）,DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/1091/1010，即每1091010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制100010000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关： （1）碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。 （2）DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。 （3）DNA的损伤修复系统。,三、大肠杆菌三种DNA聚合酶,DN
8、A聚合酶 1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶，含一个锌原子。为多功能酶，具有: （1）5 3聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）； （2）3 5外切酶活性（校对功能）； （3）还具有5 3外切酶活性（双链有效）； 该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口 的填补。,DNA聚合酶催化的反应,DNA聚合酶的功能,Arthur Kornberg 1918,Stanford University Stanford, CA, USA,The Nobe
9、l Prize in Physiology or Medicine 1959,“for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid“,DNA聚合酶,多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3 5外切酶活性。其功能可能 在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。,DNA聚合酶,含十种亚基: ()，其中()称为核心酶，2
10、称为夹子，（2）组成复合物，其主要功能是帮助亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。 因此认为该酶DNA的真正复制酶。,DNA聚合酶全酶的亚基组成,DNA 聚 合 酶 的 异 二 聚 体,前导链的合成,滞后链的合成,DNA聚合酶的-钳子俯视图,DNA双螺旋,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,四、DNA复制许多酶和蛋白因子,拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶, 在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。 除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，催化拓扑异构体之间互变
11、的酶称为拓扑 异构酶。,拓扑异构酶 使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。 拓扑异构酶 使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。 二者共同控制DNA的拓扑结构。,两类拓扑异构酶作用特点,解螺旋酶（解链酶） 通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2 ATP分子。 单链结合蛋白 稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。,引物合成酶 催化引物RNA的生成。 引发前体 它由多种蛋白质dnaA、
12、dnaB、dnaC、n、n、n和 i 组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。 引发体可以沿模板链5 3方向移动，具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n蛋白具有ATP酶活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成 方向相反。,参与DNA复制的酶 与蛋白因子总览图,4 细胞DNA复制的阶段性（以大肠杆菌为例）,一、复制的起始阶段 1、起始复合物的形成：称为引发 2、RNA引物的合成 二、复制的延长阶段 三、复制的终止阶段,复制原点oriC和原点的识别,DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点，常用ori C（或o）
13、表示。大肠杆菌的复制原点ori C由245 bp构成，含两组保守的重复序列：三个13 bp的序列（富含A、T的序列）和四个9 bp的序列；许多生物的复制原点也都富含A、T区段。 复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链（DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶、SSB），在原点处 形成一个眼状结构，叫复制眼。 从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组 独立进行复制的单位）。,复制原点ori C和原点的识别,1. 拓扑异构酶解开超螺旋。 2. Dna A蛋白识别并在ATP存在下 结合于四个9 bp重复序列。 3. 在类
14、组蛋白（HU）、ATP参与下, Dan A蛋白变性13 bp的重复 序列，形成开链复合物。 4. Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C的帮助下沿5 3 方向移动，解开DNA双链，形成前引 发复合物。 5. 单链结合蛋白结合于单链。 6. 引物合成酶（Dna G蛋白）开 始合成RNA引物。,一、复制的起始,二、链的延长,真核生物的冈崎片段为：100 - 200 bp 原核生物的冈崎片段为：1000-2000 bp,DNA链的延伸,在DNA聚合酶催化下，以四种5-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3端以磷酸二酯键连接脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链延伸的同时进行前导链和滞后链合
15、成。两条链方向相反。,冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接,前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）,DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口,作用特点,大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体DNA连接酶不仅能连接双链DNA的粘性切口，而且能连 接无粘性末端的平头双链DNA。 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重 要作用。,DNA连接酶作用机理,三、 复制的终止,顺时针终止陷阱,逆时针终止陷阱,Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致D
16、NA复制的终止。,大肠杆菌DNA 复制的终止,连环、解连环,四、真核生物DNA复制的特点,1. 真核生物染色体有多个复制起点，称自主复制序列(ARS) 或复制基因(replicator)；多复制眼，呈双向复制，多复制子。 2. 冈崎片段长约200 bp，相当于核小体长度。 3. 真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为10003000 bp/ Min（仅为原核生物的1/201/50）。 4. 真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多复制起点。,5. 真核生物有多种DNA聚合酶，DNA聚合酶（）是真正的复制酶，在增殖细胞核抗原（PCNA）存在下有持续合成能
