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1、第二章 微生物的纯培养和显微技术,微生物的分离和纯培养 1.无菌技术 2.用固体培养基分离纯培养 3.用液体培养基分离纯培养 4.单细胞（孢子）分离 5.选择培养分离 6.二元培养物 显微镜和显微技术 1.显微镜的种类及原理 2.显微观察样品的制备,微生物个体：小,利用群体研究属性,群体形式繁衍、保存,人为规定的条件下培养繁殖得到的 微生物群体为培养物,培养物,纯培养物,混合培养物,纯培养能较好地得到重复结果 ， 是微生物研究的重要技术之一,显微技术是微生物研究的另一项重要技术,个体小,一、微生物的分离和纯培养,无菌技术（aseptic technique),分离、转接、纯化时防止其他微生物污
2、染的技术,试管、烧瓶、培养皿等常用器皿 灭菌方法有：高压蒸汽灭菌、高温干热、煮沸,一、微生物的分离和纯培养,微生物培养常用器皿及灭菌,接种针或接种环分离或将微生物从一个培养器皿转接到另一个，无菌操作。火焰旁边或无菌箱或无菌室 进行。 接种针采用迅速加热和冷却的镍铬合金制备 液体培养物用无菌移液管或移液枪,一、微生物的分离和纯培养,接种操作，最基本技术,一、微生物的分离和纯培养,无菌操作台,火焰旁无菌区,用固体培养基分离纯培养,各种菌落,一、微生物的分离和纯培养,菌落(colony)：单个微生物在固体 培养基或(内层)生长繁殖形成肉眼 可见的，有一定形态结构的子细胞 生长群体。,菌落连成片为菌苔
3、（lawn）,一、微生物的分离和纯培养,不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征 （形状、颜色等），是微生物分类、鉴定的重要依据。,同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落,一、微生物的分离和纯培养,一、微生物的分离和纯培养,固体培养基：琼脂或其他凝胶物质固化的培养基。 平板：即培养平板（culture plate)。融化的固体 培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板用，于分离、培养微生物。,一、微生物的分离和纯培养,稀释平板法（pour plate method) 将细菌或其他微生物无菌水梯度稀释，取少量与冷却至50固体培养基混合，摇匀，倒入培养皿，凝固，倒置培养2
4、4小时，就会出现菌落。,一、微生物的分离和纯培养,常用固体分离纯培养方法：,一、微生物的分离和纯培养,稀释平板法,涂布平板法（spread plate method) 稀释平板法因为细菌与50培养基混合导致某些热敏感菌死亡，及好氧菌埋在培养基中缺乏氧气影响生长，所以更常用涂布平板法。,一、微生物的分离和纯培养,常用固体分离纯培养方法：,平板划线分离法（streak plate method） 接种环沾取少许微生物，在无菌平板扇形、平行等划线，随划线次数增加而分散开，得到单菌落。,平板划线分离,一、微生物的分离和纯培养,稀释摇管法(dilution shake culture method） 厌
5、氧微生物可用此法进行纯培养分离。 操作：盛培养基试管加热融化，冷却至50， 待分离材料用这些试管梯度稀释 ，摇匀，冷凝，石蜡封口,一、微生物的分离和纯培养,厌氧微生物分离装置：,一、微生物的分离和纯培养,厌氧罐,厌氧手套箱,液体培养基分离纯培养：,一、微生物的分离和纯培养,有些微生物液体培养基分离纯培养，原生动物、藻类。 稀释法： 接种物在液体培养基中顺序稀释，高度稀释，每个试管中分配不到一个。若稀释后同一梯度的平行试管中大多数（95）没有微生物生长，那么有微生物的可能是纯培养，否则可能性下降。,显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养获得纯养,一、微生物的分离和纯培养,单细胞（单孢子）显微分离
6、：,稀释法缺点,分离的优势菌,显微操作仪，专业程度高,对某微生物生长需要了解后，设计适合其生长繁殖的培养基，抑制其他菌生长，即使该微生物在混杂群体中（很 少也可)分离。,一、微生物的分离和纯培养,选择培养分离方法：,选择培养基直接分离,一、微生物的分离和纯培养,选择培养分离方法：,如：耐高温菌采用高温筛选； 蛋白酶产生菌加牛奶筛选； 抗抗生素可采用加抗生素筛选,待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制,一、微生物的分离和纯培养,选择培养分离方法：,富集培养,特定的环境条件,仅适应于该条件的微生物旺盛生长,待分离微生物在群落中的数量大大增加,从自然界中分离到所需的特定微生物,根据微生物的特殊要
7、求，从自然界分离出特定已知微生物种类；,分离培养在特定环境中能生长的微生物；,富集培养,一、微生物的分离和纯培养,二元培养物：,培养物只含两种微生物，并有意识保持两者之间 的特定关系的培养物为二元培养物。 如：病毒宿主，原生动物细小微生物,一、微生物的分离和纯培养,微生物菌种保藏技术：,为何保藏,如何保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则 生产或科研都无法正常进行。,要求：菌种不死，不污染，不变易,中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM)，中国典型培养物保藏中心（CCTCC），美国典型菌种保藏中心（ATCC）等,一、微生物的分离和纯培养,微生物菌种保藏技术：,如何保藏,根据菌种
8、特性和保藏目的不同， 给特定环境使其存活而得以保存,连续移种或改变环境条件：干燥、低温 缺氧、避光、缺乏营养等,斜面：可保存数周至数年，可用石蜡或橡皮塞封口，低 温延长保存时间 液体：菌苔制成菌悬液，低温（悬液保藏法） 缺点：繁琐、易污染、变异丧失原有特性,一、微生物的分离和纯培养,微生物菌种保藏技术：,传代保藏,斜面、半固体琼脂柱、液体,斜面制作：,一、微生物的分离和纯培养,微生物菌种保藏技术：,冷冻保藏,液氮保藏、低温冰箱等 液氮可达196，效果较好,注意：速冻，减少冰晶损伤细胞,一、微生物的分离和纯培养,微生物菌种保藏技术：,干燥保藏,沙土管保藏、冷冻真空干燥 保藏,沙土管：产孢子菌。制
9、成孢子悬液，加无菌沙土管，减压抽干水分，石蜡封口，冰箱保存。 冷冻真空干燥：加保护剂样品预先冷冻，真空冰升华去水，低温保存，保存数十年，目前最普遍、最重要的方法，菌种保藏中心多采用此法。菌种保藏时采用不同手段保藏，防止某种方法失败导致菌种丧失。,二、显微镜和显微技术,决定显微观察效果重要因素：分辨率和 反差 分辨率：辨别两点之间最小距离的能力 反差：样品与背景区别程度 普通显微镜 调焦螺旋 光学系统：物镜、目镜、聚光器,机械装置：镜座、支架、载物台、,普通显微镜结构示意图,显微镜种类和原理：,二、显微镜和显微技术,光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？,目镜：10 15 ；物镜： 1
10、00 ；总放大倍数10001500 ；,如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？,使用油镜，即在100 , 物镜和载玻片之间滴加香柏油； 香柏油与玻璃折射率相近,二、显微镜和显微技术,0.5 l 分辨率（最小可分辨距离）= n sin q,分辨率与所用波长成反比！,N：玻片与物镜间介质的折射率,空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）,显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质,二、显微镜和显微技术,二、显微镜和显微技术,浸没油与玻璃的折射率相近,很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。,暗视野显微镜,二
11、、显微镜和显微技术,活细菌在普通显微镜下是透明，观察不清，采用暗视野显微镜，如：黑夜看星星就很清楚。,暗视野显微镜结构与照明示意图,暗视野显微镜,二、显微镜和显微技术,特殊聚光器实现斜射照明，给样品照明的光线不直接穿过物镜，而经样品反射或折射后进入物镜，使样品与背景差别大，可以清楚看到透明微小颗粒。用于：生活细菌运动性观察。,相差显微镜,二、显微镜和显微技术,相差显微镜,二、显微镜和显微技术,光线透过透明标本，波长（颜色）和振幅（亮度）没有多大变化，用普通显微镜观察透明标本，其形态和内部结构难以分辨。细胞各部分折射率和厚度不同，当光线通过时，直射光和衍射光光程有差别，而人眼看不到，但是可通过相
12、差显微镜看到。 相差显微镜采用特殊光学装置：环状光阑和相差板，利用光的干涉，将光的相位差转变为人眼可见的振幅差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞内的某些显微结构。其发明人F.Zernike因此获1953年诺贝尔物理奖。,相差显微镜下的血液流动：,二、显微镜和显微技术,透射电子显微镜（简写TEM）,用波长短的电磁波取代可见光，使分辨率提高。 工作原理类似，因光源不同，有区别: 1)电子若遇空气中分子会发生偏转使物象不清楚，因此镜筒高真空 2)电子带电荷，电镜是用电磁圈使之聚焦 3)电子成像人眼看不到，用荧光屏显示或感光胶片记录,大肠杆菌 透射电子显微镜图,扫描电子显微镜（SEM）,扫描电子显
13、微镜,大肠杆菌扫描电镜图,二、显微镜和显微技术,工作原理与光学显微镜和透射电子显微镜不同，是电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。 主要用于：样品表面结构,扫描隧道显微镜（STM）,二、显微镜和显微技术,80年代出现的，原理：利用量子力学中的隧道效应。 其横向分辨率：0.10.2nm，纵向分辨率：0.001nm 这种分辨率足以对单个原子观察。 利用这种显微镜直接观察蛋白质、DNA、RNA等以及virus等结构。,厨房抹布上的细菌和霉菌,棉纤维上的汗垢,扫描隧道显微镜下的DNA,显微样品制备,
14、二、显微镜和显微技术,样品好坏直接影响观察结果。 考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制样方法，尽可能使样品生理结构稳定，采用各种方法提高反差。,二、显微镜和显微技术,显微样品制备之 光学显微镜制样,光学显微镜制样,活体观察,染色,压滴法,悬滴法,菌丝埋片法,活菌,死菌,美蓝染色,简单染色,鉴别染色,革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色,二、显微镜和显微技术,特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察 压滴法：菌悬液滴载玻片，加盖玻片直接观察 悬滴法：盖玻片滴一滴菌悬液，反转置于特制凹载玻片直接观察 菌丝埋片法：无菌小玻璃纸铺平板表面，涂布孢子悬液，培养后，取
15、下玻璃纸置于载玻片，观察,光学显微镜样品制备活体观察,活体观察难看到微生物的细致形态和结构，需染色观察。 染色前需要对样品固定，目的：杀死细菌使菌体黏附在 玻片上；还可增加对染料的亲和力。 常用：酒精火焰加热和化学固定两种方法,二、显微镜和显微技术,光学显微样品制备染色观察,二、显微镜和显微技术,大肠杆菌革兰氏染色,枯草杆菌革兰氏染色,二、显微镜和显微技术,电镜制样,显微样品制备之 电镜制样,样品观察前要固定和干燥，一般要重金属盐染色或喷镀，提高反差，使电子图像清晰。,透射电镜制样,二、显微镜和显微技术,显微样品制备之 电镜制样,覆盖有支持网的载网（一般为铜网、不锈钢、金、银等） 负染技术：电
16、子密度高、本身不显示结构、与样品几乎不反应的物质，如：磷钨酸钠进行染色。 重金属盐不被样品吸附沉积在四周，若样品具有表面结构，重金属盐就进入表面凹陷部分，通过散射电子能力差异把样品外形和表面结构衬托出来。 负染技术简便易行，病毒、细菌鞭毛、离体细胞器、蛋白质和核酸可用此方法观察。,投影技术： 超薄切片技术：,二、显微镜和显微技术,透射电镜制样,真空蒸发设备将铂或铬等对电子散射能力强的金属原子，由样品斜上方喷镀，提高样品反差。可用于病毒、细菌鞭毛、离体细胞器、蛋白质和核酸等观察。,微生物个体虽小，微弱电子束无法透过整体标本，需制成100纳米以下的超薄切片才能看清内部细微结构。基本操作过程：取样、固定、脱水、浸透与包埋、切片、捞片、染色、观察。,课后思考题,1.常用的固体分离纯培养都有哪几种？如何操作？ 2.分析、比较各类显微镜在原理、样品制备和观察方面的异、同。 3.名词解释： 菌落 纯培养 平板 富集培养 二元培养物,
