米曲霉原生质体的营养互补融合及二倍体的诱发分离

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1、真 菌 学 报 一 ,已 口 别 份 示 滋 二米 曲 霉 原 生 质 体 的 营 养 互 补 融 合及 二 倍 体 的 诱 发 分 离邢 来 君 温 廷 益 罗 会 文 候 向 东 周 与 良南 开 大 学 生 物 系 , 天 津摘 要 采 用 溶 壁 酶 加 肠 蜗 牛 酶 的 混 合 液 获 得 的 原 生 质 体 , 以 聚 乙 二 醇 , 、 。 、 。 做 为 融 合 剂 , 对 米 曲 霉 进 行 了 原 生 质 体 的 营 养 互 补 融 合 ,融 合 频 率 为 一 呱 。自 斗 个 菌 株 的 斗 对 杂 交 组 合 中 获 得 了 异 核 体 , 并 分 离 到 , 夕

2、株 绿 色 融 合 株 。 二 倍 体 的 抱 子 经和 诱 发 分 离 后 , 获 得 了 二 株 生 长 速 度 快 、 蛋 白 酶 活 性 高 和 产 抱 能 力 强 的 单 倍 体 菌 株 。关 镶 词 米 曲 霉 原 生 质 体 融 合 蛋 白 酶米 曲 霉 坛 , 口 。 是 酱 油 酿 造 中 的 重 要 微 生 物 , 在 其 生 长 过 程 中 分 泌 蛋白 酶 和 谷 氨 酞 胺 酶 等 , 对 酱 油 的 产 率 和 风 味 起 着 重 要 作 用 。 然 而 生 产 实 践 中 , 蛋 白 酶 活 性高 的 菌 株 往 往 生 长 速 度 慢 而 生 长 速 度 快 的

3、 菌 株 往 往 蛋 白 酶 活 性 低 。 因 此 , 目 前 国 内 外 利用 原 生 质 体 融 合 法 选 育 生 长 速 度 快 、 蛋 白 酶 活 性 高 的 酱 油 曲 菌 是 一 个 热 门 课 题 。 古 屋 武等 利 用 生 长 速 度 快 和 蛋 白 酶 活 性 高 的 菌 株 间 进 行 了 原 生 质 体 的 融 合 获 得 了 较 好的 二 倍 体 菌 株 牛 岛 重 臣 利 用 高 产 蛋 白 酶 和 高 产 谷 氨 几酞 胺 酶 的 菌 株 间 进 行 了 融合 , 并 对 其 菌 株 进 行 了 研 究 。 近 年 来 , 尤 其 是 日 本 国 这 方 面

4、的 报 告 甚 多 。目 前 我 国 的 酿 造 业 中 , 酱 油 曲 菌 的 选 育 主 要 采 用 物 理 和 化 学 的 诱 变 方 法 。 为 了 把 杂交 技 术 用 于 酱 油 曲 菌 的 选 育 , 我 们 搜 集 了 国 内 生 长 速 度 快 的 , 蛋 白 酶 活 性 高 的 菌 株 。 对生 长 速 度 快 而 蛋 白 酶 活 性 偏 低 的 和 蛋 白 酶 活 性 高 而 而 生 长 速 度 慢 的 口 , 以 及 “ 。 菌 株 间 进 行 了 原 生 质 体 的 融 合 , 对 融 合 的 二 倍体 进 行 了 诱 发 分 离 , 从 大 量 的 单 倍 体 分

5、离 子 中 选 育 了 二 株 生 长 速 度 快 蛋 白 酶 活 性 高 的 菌株 。材 料 和 方 法一 菌 种 和 培 养 基菌 种 的 来 源 和 特 性 列 于 表 中 。完 全 培 养 基 见 邢 来 君 等基 本 培 养 基 同 上酪 素 平 板 培 养 基 , , ,。 牛 , , , , 酪 素 呼 呱 , , 蒸 馏一 一 收 稿 。温 廷 益 、 罗 会 文 、 侯 向 东 为 本 科 毕 业 生 , 毕 业 论 文 参 加 了 本 文 的 工 作 。真 学 报 卷农 菌 种 的 来 派 和 特 性五菌菌 株株 直 接 亲 本本 诱 变 处 理理 营 养 要 求求】 边】

6、刀么 君 亏 , 精 氨 酸酸, , , 尸 口 口 护 十 苯 丙 氨 酸酸汉 君 腺 嚷 吟吟人人人人人, 名 口 醉 母 育育水 , 一 , 分 钟 灭 菌 备 用 。献 曲 培 养 基 豆 饼 粉 帕 , 鼓 皮 帕 , 料 水 一 。 , , 。 , 灭 菌 初 分 钟再 生 和 融 合 培 养 基 用 。 配 制 的 和 培 养 基 。二 融 合 剂聚 乙 二 醇 上 海 试 剂 一 厂 , 气 相 色 谱 纯 。融 合 剂 肠 , , 灭 菌 分 钟三 原 生 质 体 的 制 备 和 分 离见 邢 来 君 等四 原 生 质 体 触 合 处 理 及 触 合 率 的 计 算混 合 等

7、 量 的 经 过 纯 化 的 两 株 营 养 缺 陷 型 原 生 生 质 体 二 , 转 离 心 洗 涤 分 钟 , 除 去上 清 液 , 加 人 适 量 的 予 热 的 融 合 剂 , 在 保 温 分 钟 , 使 融 合 剂 与 原 生 质 体 充 分 接 触 , 然 后 用作 系 列 稀 释 , 分 别 取 稀 释 液 于 高 渗 固 体 和 培 养 皿 内 均 匀 涂 布 , 培 养 三 天 。 对照 组 以 。 代 替 融 合 剂 , 根 据 高 渗 和 上 生 长 的 菌 落 数 计 算 融 合 率 , 参 见 梁 平彦 等 , 色 。五 倍 性 测 定 、抱 子 体 积 的 测 定

8、取 上 生 长 的 成 熟 抱 子 , 在 油 镜 下 测 定 个 抱 子 的 直 径 , 取 平 均 值 , 按 公 式 体 积 , 直径 计 算 。抱 子 含 量 的 侧 定取 上 生 长 成 熟 的 抱 子 , 过 滤 除 菌 丝 , 离 心 洗 涤 二 次 , 调 整 抱 子 量 为 护 个 了 , 方 法 见 梁 平彦 等 。六 杂 种 的 诱 发 分 离 诱 发 分 离采 用 一 对 氟 苯 丙 氨 酸 制 备 的 培 养 基 平 板 , 将 融 合 二 倍 体 划 线 分 离 培 养 , 培 养 天 后 出 现 异 样 菌 落 , 转 接 一 次 后 出 现 角 变 菌 落 。

9、将 角 变 菌 落 的 抱 子 稀 释 后 接 种 于 酪 素 平板 , 培 养 小 时 , 挑 选 透 明 圈 与 菌 落 直 径 比 值 高 的 菌 株 进 行 复 筛 , 侧 定 倍 性 和 蛋 白 酶 活 性 。 诱 发 分 离首 先 对 二 倍 体 菌 株 制 作 致 死 曲 线 和 。 曲 线 , 选 取 最 佳 诱 变 时 间 , 然 后 将 斜 面 培 养 六 天的 杂 种 抱 子 悬 浮 于 。 呱 溶 液 中 , 经 分 钟 剧 烈 摇 动 后 用 漏 斗 过 滤 , 将 抱 子 数 调 整 为邢 来 君 等 米 曲 霉 原 生 质 体 的 营 养 互 补 融 合 及 二

10、倍 体 的 诱 发 分 离 个 , 取 以 抱 子 悬 浮 液 于 直 径 平 皿 中 , 进 行 诱 变 , 诱 变 后 接 种 于 酪 素 平 板 上 , 挑选 透 明 圈 与 菌 落 直 径 比 值 高 的 菌 落 进 行 复 筛 。 测 定 倍 性 和 蛋 白 酶 活 性 。七 蛋 白 醉 活 性 的 生 物 浏 定水 解 酪 素 平 板 的 侧 定 试 验以 透 明 圈 直 径 与 菌 落 直 径 的 比 值 做 为 蛋 白 酶 活 性 的 定 性 指 标 , 用 于 初 筛 , 方 法 见 马 清 和 等。福 林 酚 法 测 定 蛋 白 酶 活 性实 验 方 法 见 赵 玉 莲实

11、验 结 果一 原 生 质 体 的 融 合以 务 溶 壁 酶 加 务 娱 牛 酶 混 合 液 酶 解 而 获 得 的 营 养 缺 陷 型 的 原 生 质 体 邢 来 君 等, 经 配 制 的 融 合 剂 处 理 分 钟 , 在 显 微 镜 下 可 见 到 一 个 原 生 质 体 的 聚 合现 象 , 经 高 渗 液 体 培 养 基 系 列 稀 释 后 , 分 别 取 。 接 种 于 高 渗 和 上 ,在 培 养 小 时 , 计 算 融 合 频 率 , 结 果 见 表 。农 公 并 缺 陷 型 曹 株 间 的 触 合 率融 合 菌 株” 主在 上 形 成 异 核 体 菌落 数 口在 上 原 生 质

12、 体 再 生的 菌 落 数互 补 融 合 串众也 也仁, 。正 “ 。 一一。冲二 二 倍 体 的 确 定通 过 表 的 斗 组 融 合 处 理 , 将 异 核 体 菌 株 在 平 板 上 转 接 培 养 后 , 获 得 株 绿色 融 合 株 。 绿 色 株 在 高 渗 上 能 互 补 生 长 , 并 出 现 黄 色 、 白 色 、 绿 色 的 菌 落 。 在上 出 现 亲 本 类 型 的 分 离 , 形 成 绿 色 的 扇 形 角 变 和 斑 点 。 此 绿 色 抱 子 株 能 在 上 生 长且 较 亲 本 旺 盛 , 产 抱 量 大 , 属 原 养 型 。 其 抱 子 含 量 接 近 两

13、亲 本 之 和 , 抱 子 体 积 也 较亲 本 大 表 , 故 认 为 绿 色 抱 子 株 是 细 胞 核 融 合 的 杂 合 二 倍 体 古 屋 武 等 , 。 二 倍 体的 性 状 是 稳 定 的 , 传 接 代 后 未 见 分 化 现 象 。三 二 倍 体 的 诱 发 分 离从 选 出 的 株 绿 色 融 合 株 中 , 对 其 进 行 值 的 初 筛 , 选 出 一 、 、 、 一 、一 、 、 、 、 、 、 一 共 株 菌 进 行 了 诱 发 分 离 。诱 发 分 离杂 种 在 不 同 浓 度 的 平 板 上 , 一 般 转 接 一 次 后 开 始 出 现 角 变 和 斑 点 ,

14、 角 变 初期 为 黄 绿 色 , 抱 子 成 熟 后 变 为 绿 色 。 在 一 浓 度 的 平 板 上 都 可 以 诱 发 二 倍体 出 现 角 变 , 诱 发 过 程 中 出 现 的 黄 色 和 白 色 菌 落 的 抱 子 可 能 是 亲 株 的 恢 复 类 型 。真 菌 学 报 卷裹 杂 种 倍 性 的 确 定杂 种 与 亲 本菌 株抱 子 直 径仁拼抱 子 体 积 抱 子 体 积 之 比 杂 种 与 亲 本含 量 之 比记拜倍 性含 量群, 。,。, 由,乙网了月了劝片工, 、。 乙吕 户, ,弓。咚 。 。亏 。一一一从 株 杂 合 二 倍 体 中 分 离 出 株 单 倍 体 分

15、离 子 , 在 复 筛 过 程 中 选 出 知 , 菌 株 , 该株 是 由 。 与 二 。 杂 交 获 得 的 融 合 株 中 选 育 的 。 对 其 生 理 性 状 进 行 了 测 定 表。表 单 倍 体 菌 株 叨 和 生 理 性 状飞 , , , ,菌菌 株株 抱 子 颜 色色 生 长 速 度度 曲 抱 子 含 量量 蛋 白 酶 活 性性吕原原 始 亲 本 , 斗 弓弓原原 始 亲 本 , 。 斗杂杂 种 多 斗 。分分 离 子 , 。 , 。 。 ,分分 离 子 。 。 , 。,从 表 中 可 以 看 出 , 融 合 株 的 原 始 亲 本 之 一 。 。 。 具 备 生 长 速 度

16、 快而 蛋 白 酶 活 性 偏 低 , 而 另 一 原 始 亲 本 。 , 。 。 , 却 具 备 蛋 白 活 性 高 而 生 长 速 度 慢邢 来 君 等 米 曲 霉 原 生 质 体 的 营 养 互 补 融 合 及 二 倍 体 的 诱 发 分 离的 特 性 。 融 合 株 同 时 具 备 了 上 述 两 个 优 点 。 对 诱 发 分 离 获 得 的 单 倍 体 , 。 , 菌株 表 一同 样 具 备 了 生 长 速 度 快 蛋 白 酶 活 性 高 的 优 点 , 也 就 是 说 菌 株 在 分 离 过 程 中获 得 了 菌 株 的 优 点 , 其 生 长 速 度 与 基 本 相 同 , 而 蛋 白 酶 活 性 比 其 提 高 一 倍 多 。农 , 。 和 倍 性 的 测 定, ,菌菌 株株 抱 子 体 积积 杂 种 与 单 倍 体体 含 量量 杂 种 与 单 倍 体体 倍 性性袍 子 体