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1、第八章 位点特异性重组与DNA的转座,1. 保守性位点特异性重组 2. 位点特异性重组的生物学作用 3. 转座 4. 转座子及其调控,本章内容,重组的两种形式,一、保守性位点特异性重组（CSSR）,1. 位点特异性重组发生在目标DNA上的特异序列中。,噬菌体基因组嵌入 宿主染色体中。,3种CSSR重组方式。,参与保守性位点特异性重组的结构。,位点特异性重组的分子机制：attP和attB交错切割发生重组。,噬菌体的attP 为P.O.P ,细菌的attB为 B.O.B O 为 attP 和attB相同的核心序列，长15bp，重组发生在此序列中。 attP 235 bp attB 23 bp P-
2、O-P B-O-B -152 0 +82 -11 0 +11 G C T T T T T T A T A C T A A C G A A A A A A T A T G A T T ,2. 位点特异性重组酶利用共价蛋白-DNA中间体切割分离与连接DNA。 -位点特异性重组酶有两个家族：丝氨酸重组酶与酪氨酸重组酶。,丝氨酸重组酶与酪氨酸重组酶使用的共价蛋白-DNA中间体。,重组酶的家族与功能,丝氨酸重组酶催化的重组。,二、位点特异性重组的生物学作用,细胞与病毒用位点特异性重组可实现各种各样的生物学功能。 -噬菌体利用重组机制在感染时将本身DNA嵌入到宿主染色体中。 -位点特异性重组可用于改变基因
3、表达。 -位点特异性重组还广泛用于DNA复制、同源重组和细胞分裂周期中保持环状DNA分子的结构完整。,1. 嵌合酶可促进病毒基因组与宿主细胞 染色体的嵌合和分离。,2. 噬菌体的分离需要一种新的DNA弯曲蛋白。,重组位点。,IHF弯曲DNA进入DNA结合位点模型。,3. Hin重组酶反转DNA片段使其他基因表达。,沙门氏菌感染人类细胞的电镜图,沙门氏菌重组催化DNA反转,4. Hin重组需要一个DNA增强子。 5. 重组酶将环状多聚DNA分子转化为单体。 6. 其他机制。,转座因子的发现,B. McClintock的玉米遗传研究 1951年，B.McClintock根据长期对玉米的遗传研究，提
4、出了转座（transposition）的概念，提出基因可以移动的新观点。 Shapiro的E.coli半乳糖操纵子研究 半乳糖操纵子 galK基因编码半乳糖激酶； galT基因编码半乳糖尿苷酰转移酶； galE基因编码半乳糖异构酶。,三、转座,半乳糖操纵子,1. 一些遗传元件通过转座（transposition）转到 新的染色体位置上。,2. 有3种类型的转座因子。 -DNA转座子 -类病毒反转座子 -poly-A反转座子,基因组中的转座子：出现位置与分布,原核生物转座因子,类型 （1）插入序列（insertion sequence ,IS） E.coli K12中有IS1, IS2, IS3
5、, IS4, IS5。 E.coli的F因子中有IS2, IS3(4个),，。 末端的序列相同或相近，但方向相反，称为反向重复序列（IR），与其相连的宿主DNA末端会产生正向重复序列（DR）。 仅编码与转座有关的转座酶，转座酶交错切割宿主DNA，然后IS插入，IS两端形成DR。,IS的结构与功能,部分IS的结构,靶重复的形成,（2）复合转座子（composite transposon） 两端由IS元件组成，元件相同或不相同，方向相同或不相同；两端元件都有功能或仅一侧元件有功能。 中心区域编码抗性标记，不同复合转座子的抗性标记不同，例如Kanr 、Camr 、Strr 、Bler 等。 两个IS
6、元件能够使它们之间的DNA序列转座。,复合转座子的结构,真核生物转座因子,玉米的转座因子 （1） McClintock的发现 玉米的红色花青素合成受多基因控制，使胚乳呈紫色。其中任一基因突变都使色素合成受阻，胚乳变白。如果发生回复突变，会导致斑点产生。McClintock发现，色素基因C突变是由“可移动的控制因子”引起的，称为解离因子（dissociator ,Ds），它可插入C基因中。另一可移动的控制因子是激活因子（activator,Ac），Ac能激活Ds转入C基因，也能使Ds从C中转出，这就是Ac-Ds系统。,玉米色斑的形成,（2）玉米的控制因子家族 McClintock还发现了Spm-
7、Dspm系统。每个家族都有自主性因子和非自主性因子。 自主性因子有切离和转座能力。可插入任何位点产生不稳定的或可“突变”（mutable）等位基因。自主性因子的丢失，可使可变的等位基因变成稳定的等位基因。 非自主性因子是稳定的，自身不能转座，来源于失去反式作用功能的自主因子，而这种功能是转座所必须的。 控制因子家族是通过这两种因子相互作用来划定的。一个家族由单个类型的自主因子组成，这些因子由很多种非自主因子相伴随。, 玉米Ac-Ds系统的结构 Ac序列由含5个内含子的单个基因编码，其产物为转座酶，末端有11bp的IR和8bp的DR。 Ds是由Ac缺失产生的，Ds9缺失194bp；Ds6只保留2
8、Kb。转座酶失活但保留完整的转座酶作用位点（包括末端）。 Ac-Ds属于非复制型转座，发生转座后，它们从供体位置上消失。,果蝇的P因子 （1）果蝇的“杂种不育”品系 某些果蝇品系杂种后代现一系列缺陷，在P-M系统的杂交中，子一代具有正常的体细胞组织，但性腺不能发育。 P() P() F1 正常能育 M() M() F1 正常能育 M() P() F1 正常能育 P() M() F1 不育,（2）P 因子 研究发现，杂种不育是由于在W位点插入P因子（P element）所致，P品系有P因子，M品系无P因子。 P因子长2.9 Kb ，有4个开放阅读框(ORF)，末端有31bp反向重复序列，靶DNA
9、产生8bp的正向重复序列。 一个P品系果蝇带有30-50拷贝的P因子，其中1/3具完整结构，不完整的P因子是由于缺失而产生的，丧失转座能力。 P因子的激活有组织特异性，它仅发生在生殖细胞中。但P因子在体细胞和生殖细胞中都转录。组织特异性表现在不同的细胞中转录的方式不同（剪接方式不同）。,（3） P因子的组织特异性表达 P因子有3个内含子，4个开放阅读框（ORF0-ORF3） 初始转录本有2.5Kb和3.0Kb两种长度的RNA 不同组织中产生不同的蛋白质： 在体细胞中，剪切内含子1和内含子2，保留内含子3；产生ORF0-ORF1-ORF2编码区，翻译成66KDa蛋白，是一种转座的阻遏物。 在生殖
10、细胞中，剪去3个内含子，产生4个阅读框的编码区，翻译成87Kda蛋白，是一种转座酶。,P基因的结构及其表达产物,（4） P() M() 杂种不育的解释 杂种不育主要原因是内含子3的组织特异性剪接。 P ()P () 66KDa蛋白阻止P元件转座 M ()P () 66KDa蛋白阻止P元件转座 P ()M () 父本P产生87Kda蛋白（转座酶）， 导致后代不育。,果蝇不同杂交组合 P产物对育性的影响,3. 转座的类型 复制型转座： 转座元件被复制，转座的序列是原元件的拷贝。转座子复制后一个拷贝保留在原位，一个拷贝转移到另一位置。 非复制型转座：转座元件从一个位置转移到另一位置。 保守型转座：另
11、一类非复制型转座。转座因子从供体位点上切离，插入靶位点上，供体上转座子两侧的DNA双链被保留。,复制型转座的基本过程 复制型转座要产生一个共合体，其原理是：游离的3端以已连接的转座子为模板进行复制、连接，使转座子产生重复，形成共合体。,共合体的形成,Mu噬菌体转座产生共合体,非复制型转座的基本原理 转座子插入靶DNA，两侧为靶DNA正向重复序列，供体部位留下缺口。 模式1 转座因子和受体分子形成形成交叉结构，受体分子的单链切口与转座因子单链游离末端连接，并在插入位点上产生正向重付序列，通过交换使转座因子转座到受体分子。 模式2 供体分子上转座因子两端产生双链断裂，使转座因子释放出来，然后在受体
12、分子产生的交错接口处插曲。,非复制型转座模式1,非复制型转座模式2,4. 反转录病毒和反转座子 转座子是基因组中独立的可移动的DNA序列。从DNA到DNA的转移称为转座。从DNA到RNA再到DNA的转移称为反转座。反转座是由RNA介导的转座过程。 以RNA为中间体的转座为真核生物所特有。反转录病毒能将其RNA基因组的DNA拷贝以原病毒的形式整合到宿主基因组中。一些真核生物转座子的结构与原病毒的结构有关，并且通过RNA中间体进行转座，这一结构单位称为反转录转座子(retrotransposons) 或反转录子(retroposons)。,（1）反转录病毒及其生活周期 反转录病毒具有单链 RNA基
13、因组 每个病毒颗粒包装有两个RNA基因组，因此，单一病毒颗粒实际上是二倍体。 反转录病毒生活周期 反转录病毒（正链病毒）感染细菌病毒RNA反转录DNA（负链DNA）催化合成第二条DNA链（正链DNA）整合到宿主DNA中成为原病毒转录生成病毒基因组RNA(转录出病毒mRNA、翻译成病毒蛋白质或者作为子代病毒基因组）,反转录病毒生活周期,（2）反转录病毒基因组结构与功能 含有3-4个基因，实为编码区，每各编码区通过加工产生多种蛋白（多聚蛋白），经酶切成为单一的蛋白质形式。 反转录病毒mRNA通常结构，5 端加帽，3端与polyA相连。 全长的mRNA被翻译时，产物为gag和pol 蛋白。翻译从第一
14、个起始密码子开始而终止于第一个终止密码子，产物为gag蛋白。表达pol 蛋白必需越过终止密码子，效率为5%，因此，gag蛋白是gag-pol蛋白的20倍。 经剪切产生一个短的亚基因组 (subgenomic) 的 mRNA，其表达产物为env。,反转录病毒“基因”的表达,（3）反转录病毒的结构形式 病毒基因组RNA结构 两个末端有正向重复序列R (10-80bp) ，5 端R之后是 U5 (80-100bp) ；3端R内侧是U3 (170-1260bp)。 病毒线形双链DNA结构 5 端加U3，3端加U5。 U5RU3 称为长末端重复（LTR）。 原病毒RNA结构（类似转座子） U3和U5末端
15、丢失2bp，靶DNA两侧产生4-6bp重复序列,LTR的结构,（4）病毒线性DNA整合到宿主基因组 整合过程由整合酶催化，在3端切除CA两个碱基，成为粘性末端。 靶位点随机选择，交错切割5 端4-6个碱基。 整合酶将LTR 3端与靶DNA 5 端连接。 一个连续感染的细胞可获得1-10个原病毒。 每个LTR的U3有一个启动子，左侧LTR中的启动子发起与整合位点相连接的宿主序列的转录。这个LTR带有一个增强子，可以作用于细胞和病毒的序列。一个反转录病毒的整合可能使某些基因激活，使宿主细胞转变为肿瘤细胞。,（5）病毒类反转座子 反转录病毒是反转座子的范例，其转座能力是由于能编码反转录酶和整合酶。
16、反转座子和反转录病毒的区别在于其不经特异的感染形式，但转座机制相似。 反转座子分为两类：病毒类反转座子和非病毒类反转座子。,（6）非病毒类反转座子 非病毒类反转座子的内部和外部结构它们来源于RNA序列，是细胞内发生了突变基因的产物。可以假定它们是负责转座的酶系统的底物，但它们不编码有转座功能的蛋白质。 哺乳动物基因组中，有一类核苷酸序列高度相似的重复序列，主要是基因以外的DNA序列。可分为串联重复序列和散在重复序列。它们多来源于RNA介导的转座过程，来源于反转录转座子。 散在重复序列是中度重复序列，根据重复序列的长度分为两类：短散在重复序列( SINEs )和长散在重复序列( LINEs )。, 短散在重
