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1、抗菌药物敏感试验折点研究技术指导原则（网上征求意见稿）一、 概述（一） 目的本指导原则为药品注册申请人和临床试验研究者在规划、设计、实施和监督抗菌药物敏感试验折点（以下简称：抗菌药物折点）研究和敏感标准制定提供必要的技术指导，使安全有效的抗菌药物得以更好更早地用于临床治疗。本指导原则主要适用于全身用药的创新性抗菌药物的临床试验。（二） 意义抗菌药物折点（breakpoint）用来判断病原菌对药物敏感、中介或耐药，其结果是临床医生选择抗菌药物治疗病原菌感染的重要依据。我国目前还没有折点制定原则，抗菌药物临床应用时所采用的折点多是国际已有的标准，但对于自主研发的I类新抗菌药物等，无国际折点参考。必
2、须进行相关研究以制定药敏折点，保障临床医生能根据正确的药敏结果，合理应用抗菌药物。（三） 基本研究过程及与抗菌药物研发的整体关系抗菌药物折点的确立涉及临床前体内外抗菌作用研究、药物代谢动力学研究、临床各期研究等多个药物研发环节，是新药研究中的一项重要内容。折点研究贯穿新药研究全过程，其研究原理可以概括为：在了解药物自身的抗菌特点、对各种致病菌作用强弱后，通过体外和动物试验，或直接通过动物试验，建立PK/PD指数及反映疗效的靶值。并利用此指数、靶值与人体结果有较好一致性的特点，进而建立抗菌药物体外抑菌浓度与预期临床疗效间的关系，最终确定对感染部位使用推荐药物剂量时，该致病菌株能被通常可达到的抗菌
3、药物所抑制的浓度。折点制定过程中，有些数据可能来源于其他研究项目。如：菌株的MIC值、药物杀菌曲线、抗生素后效应值、药物血浆蛋白结合率、药物人体药代参数等。当使用外来数据时，首先要求数据可溯源。其次，测定、分析方法符合折点制定的要求。如：MIC测定所用方法相同、测定范围需涵盖整个MIC分布；杀菌曲线图能反映出完整的药物浓度对杀菌速率的影响等。（四） 应用范围本指导原则主要用于指导新抗菌药物折点研究，目前仅限定为抗细菌药物，创新抗真菌药物也可参照。二、 实验室要求（一） 实验室资质获得有质控和质量保证的各项试验结果是确定准确折点的基础。对于开展体外药效学研究的实验室，在进行折点相关的微生物实验时
4、，需要全程伴随质控；同时在实验过程中，尽量采用国际通用的研究方法，使获得的不同地区和国家的数据具有可比性。对于开展药代动力学研究的实验室，包括生物样品分析、药代动力学统计分析等，同样应建立相应的质量保证体系。进行感染动物PK/PD指数及靶值确定的动物实验室应为符合国家要求、具有实验动物使用许可证的从事感染动物研究的实验室。具体要求可参照各项试验相关的指导原则。（二） 人员资质各项实验人员应具有相应的实验技能与工作经历，应经过GCP培训并获得证书。经过其所从事专业的培训，具有满足试验要求的试验能力或获得相关证书。如：从事动物试验的人员应具有实验动物从业人员上岗证等。了解实验室的各项管理规范与操作
5、规程。（三）统计与数据管理执行抗菌药物临床试验微生物实验室技术指导原则和抗菌药物药代动力学/药效学研究技术指导原则中关于统计分析与数据管理的各项规定。（四）注意事项/问题处理折点建立需运用体外、动物药代、药效、人体药代、临床疗效等多种数据，这些数据伴随着药物研发逐步积累。多来源的数据可增加代表性与可靠性，但同时也对数据质量提出更高要求。因而，药物研发者应在早期对折点建立方法详细了解，每一阶段的研究研究中，除应符合个阶段研究要求，还需考虑最终数据的统合，制定较为统一的研究方案与质量控制、保证体系，使研发过程中更多的数据可纳入到折点制定中来。如：在早期体外药效学研究中，即开展MIC测定方法的比较研
6、究，最终确定适合研发药物的测定方法并在以后的研究中保持一致。再如：临床研究的同时开展患者PK/PD研究或PPK研究，同时获得多方数据。三、 流行病学界值（Epidemiological Cutoff, Ecoff）的建立（一） 菌株要求由于临床微生物存在着耐药的变迁和区域的差异，测试菌株应为近3年内临床分离非重复菌株（一些收集困难的菌种可考虑5年内的临床分离株）。来自3个或以上有代表性地区。针对该抗菌药物抗菌谱中的临床常见致病菌种，以种为单元进行统计分析。理论上，同一属或科的不同菌种间，如MIC众数相差在2倍或以内，可合并统计。考虑到实用性，也可参考CLSI（http:/www.clsi.or
7、g）和EUCAST（http:/www.eucast.org）的细菌分组方式，每组为一统计单元。每单元进入统计的野生型株数不少于100株，其中肠杆菌科、葡萄球菌属等单元，由于其中包含的菌属、菌种较多，每单元测定菌株数一般不少于300株。葡萄球菌属应包含金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌。（二） 测定方法按照CLSI和EUCAST有关抗菌药物敏感试验稀释法要求，采用肉汤稀释法或琼脂稀释法进行MIC测定。之前药效学研究如已证明2种测定方法无显著差异，可任选一种方法；如之前未做方法学比较研究，需在此进行方法学比较并明确该药物体外药敏试验方法。药物浓度选择：需要选择较宽的药物浓度范围以涵盖菌株的全部MIC分布
8、，以便画出完整的MIC分布图形。测定单位数量：MIC测定需在3个或以上不同单位进行。测定前制定统一方案，采用相同的测定方法及相同的材料。各单位测定结果差异不宜过大（MIC分布在正负一个稀释度），如差异过大，需分析原因，重新考评各测定单位等。（三） 结果判定频数分布图目测方法：以MIC值为横坐标，菌株数或菌株所占百分比为纵坐标作图。野生型菌株MIC呈对数正态分布。取一个完整正态分布的高MIC值端为Ecoff1。当分布呈现双峰形态时，说明所测菌株中含非野生型菌株，需剔除后重新作图计算。这种方法简易直观，对于MIC具有单峰或明显双峰分布的细菌-药物组合（图1-a，1-b）效果较好，而对于野生型和非野
9、生型有部分重合的细菌（图1-c）则效果不好。aEcoffbC图1 MIC分布与Ecoff确定统计学方法2：基于对数正态分布这一特性，选择合适的统计学方法，如：非线性最小二乘回归等，对不同范围实测值进行拟合（如图1-c，分别对MIC值0.0160.125, 0.0160.25，0.0168的不同亚区间进行拟合）。以拟合值与实测值相差最小的点为Ecoff。统计学方法的优势在于不会因人而异，并且可以给出正确概率。五、PK/PD界值（Pharmacokinetics/Pharmacodynamics Cutoff, PK/PD Cutoff）的建立（一） 建立PK/PD界值所需的体外研究包括：确定抗菌
10、药物杀菌模式、后效应（postantibiotic effect, PAE）以及获得人体给药后的不同时间游离药物浓度数据。抗菌药物杀菌模式的确定：这部分数据在临床前的药效学研究中应与体现。随药物浓度增加，特别是在大于48倍MIC药物浓度后，杀菌速度与程度仍相应增加，为浓度依赖型杀菌药物，而相关性不好的提示为时间依赖型杀菌药物。另外，还需要确认新抗菌药物是否具有中等或较长的PAE。测定新抗菌药物人血浆蛋白结合率（f）：PK/PD研究中抗菌药物的PK参数应基于游离药物浓度得到，因此需测定药物人血浆蛋白结合率。目前常用检测血浆蛋白结合率实验方法有平衡透析法、超过率法等。以上3个数据可由临床前的药效（
11、杀菌模式、PAE）、I期临床试验（血浆蛋白结合率）中获得。其中药物杀菌模式和PAE作为之后确立与疗效相关PK/PD参数的验证。血浆蛋白结合率则直接用于之后的计算中。（二） 确立与疗效相关PK/PD指数PK/PD 指数包括f TMIC%，f AUC/MIC，fCmax/MIC，不同类型抗菌药物与三个指数的相关性也不同，浓度依赖型杀菌药物通常与疗效相关PK/PD指数为f AUC/MIC或fCmax/MIC；时间依赖型杀菌药物，根据其PAE长短，分别对应f AUC/MIC和f TMIC%。确定与疗效相关的PK/PD指数可直接在动物模型中进行，也可先在体外建立动力学模型，而后对重要数据结果在动物模型中
12、加以验证1在动物模型中确立相关PK/PD指数动物PK/PD模型可以使用来自人体感染的病原菌建立，其确定的PK/PD指数及靶值与临床研究结果有较好的一致性，因此，来自动物的PK/PD研究所获得的指数和靶值对确定人体的PK/PD界值非常有帮助4。建立感染动物模型，主要有免疫缺陷小/大鼠大腿感染模型、免疫缺陷小/大鼠肺炎模型等。以上2种模型为研究最成熟、使用最多的模型，也可根据药物自身特点及预计临床适应证，选择相应其他模型，如：脓毒血症模型、尿道感染模型等。不论哪种模型，都应首先造成免疫缺陷状态以排除不同免疫力对结果的干扰，直接观察药物对细菌的作用。常用腹腔注射环磷酰胺的方法致小/大鼠中性粒细胞缺少
13、（MIC%为相关性最好指数。图3 喹诺酮类药物治疗金黄色葡萄球菌小鼠大腿感染PK/PD分析6图4 头孢类药物治疗肺炎链球菌小鼠肺炎PK/PD分析需要测定的菌株种类与数量：针对新抗菌药物抗菌谱和预计临床适应证选择，应覆盖主要目标适应症细菌，一般需35株，且部分菌株的MIC值应在其野生型分布的高MIC值端。菌种中有药敏试验质控菌株的建议首选质控菌株，。2建立体外动力学模型，确立PK/PD相关指数所建体外动力学模型需满足以下2个条件：1 至少可模拟出一级动力学的浓度变化，即通过泵速和容器容积的调节，造成药物浓度呈指数型衰减，可以准确模拟人体血药浓度半衰期；2 药物浓度动态变化时，保证细菌浓度不被稀释
14、。通过所建体外动力学模型，采用剂量解析法，测定不同菌种的不同菌株在不同给药条件下菌落数的改变，作图得到PK/PD相关指数（同动物模型研究方法）。体外动力学模型与动物体内感染模型相比有以下优点：1 较易模拟人体血药浓度的变化；2 便于采集多点样本；3 减少动物的消耗；4 对在动物体内不易生长的菌种特别有用。缺点是：1 完全不包含生物体对感染与药物的应答；2 对技术要求高，有些技术问题，如细菌吸附、污染和过滤层阻塞等，如处理不好会影响试验结果。因此，如果采用体外动力学模型进行PK/PD相关指数研究，还需对重要数据以动物模型加以确认，但可以减少动物实验时的菌株数量、给药剂量以及给药间隔。此外，体外建模通常是模拟血药浓
